張曉景，王童，孔繁秀，劉宇航，陳宇鑫，張亮，李玲，司軍強(qiáng)

[石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1.生理教研室（新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），2.醫(yī)學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，新疆 石河子832000]

心臟作為高血壓直接損傷的靶器官之一，最顯著的特征性病理變化是心肌肥厚，以左心室肥厚最為明顯[1]。高血壓所致的心室壁增厚和心室?guī)缀螛?gòu)型改變稱為高血壓心肌重構(gòu)。自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous hypertensive rat,SHR）的肥厚心肌中間隙連接蛋白43（connexin 43,Cx43）表達(dá)上調(diào)且分布紊亂[2]。硫化氫H2S 可改善由亞硝基左旋精氨酸甲酯（l-nitro-arginine methyl ester,L-NAME）誘導(dǎo)的高血壓性心臟病[3]，可抑制腎血管性高血壓大鼠的心肌重構(gòu)[4]，還可以抑制大鼠因高鹽飲食導(dǎo)致的心肌肥厚[5]。然而H2S 是否通過間隙連接蛋白影響心肌重構(gòu)的研究甚少，因此，本文以SHR為研究對象，應(yīng)用分光光度計(jì)檢測硫氫化鈉NaHS 對外周血及心肌組織中內(nèi)源性H2S 含量的影響，應(yīng)用蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin,HE）染色及馬松（Masson）三色染色觀察心肌重構(gòu)情況，通過免疫組織化學(xué)檢測H2S 對間隙連接蛋白40（Connexin 40,Cx40）、Cx43表達(dá)的影響；通過Western blotting 檢測H2S 對Cx40、Cx43 及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、骨橋蛋白（Osteopontin,OPN）表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，由此來探討H2S 對心肌重構(gòu)的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取8 周齡SHR 雄鼠16 只和同齡Wistar 京都（Wistar-Kyoto,WKY）雄鼠8 只，清潔級，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[動(dòng)物合格證號：SCXK（京）2016-0006]，動(dòng)物適應(yīng)飼養(yǎng)1 周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物房室內(nèi)溫度為20 ～25℃，濕度為50%～ 55%。大鼠分籠喂養(yǎng)，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由進(jìn)食水，環(huán)境安靜。

1.2 主要試劑

NaHS（美國索萊寶公司），H2S 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），Masson 三色染色試劑盒、HE 試劑盒（北京索萊寶公司），Cx43 抗體、OPN 抗體（英國Abcam 公司），Cx40 抗體、α-SMA 抗體（美國Bioworld 公司）。

1.3 主要儀器

全自動(dòng)大小鼠無創(chuàng)血壓測量儀（四川成都泰盟公司），光學(xué)顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司），臺(tái)式高速低溫離心機(jī)（德國Eppendorf 公司），分光光度計(jì)（德國Eppendorf 公司），電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司），電泳儀、電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組及模型復(fù)制將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為SHR對照組、SHR+NaHS 組和WKY 組，每組8 只。SHR+ NaHS 組腹腔注射NaHS 56 μmol/（kg·d），SHR 對照組和WKY 組每日腹腔注射等量生理鹽水，持續(xù)8 周。

1.4.2 動(dòng)物血壓測量使用全自動(dòng)大小鼠無創(chuàng)血壓測量儀測量WKY 大鼠和SHR 尾動(dòng)脈收縮壓。使用前預(yù)熱15～20 min，將大鼠尾根部套在血壓計(jì)的充氣尾套內(nèi)，待大鼠安靜后重復(fù)測量3 次，取平均值。

1.4.3 大鼠外周血及心肌組織H2S 含量的測量大鼠稱重后腹腔注射水合氯醛麻醉，立即抽取外周血，同時(shí)取出心臟，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）將大鼠心臟漂洗干凈，按試劑盒說明書步驟測量外周血及心肌組織中H2S 的含量。

1.4.4 大鼠心肌病理形態(tài)及心肌纖維化程度的觀察用手術(shù)刀將大鼠心臟縱切成片，置于甲醛中固定48 h，制成4 μm 厚的石蠟切片，烘干后經(jīng)過脫蠟、蘇木 精染色、藍(lán)化、伊紅染色、脫水、中性樹膠封片、鏡檢等步驟完成HE 染色；經(jīng)過脫蠟、鐵蘇木精染色、酸性乙醇分化、Masson 藍(lán)化液返藍(lán)、麗春紅染色、磷鉬 酸退紅、苯胺藍(lán)染色、脫水、透明、中性樹膠封片、鏡 檢等步驟完成Masson 三色染色；光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠心肌病理形態(tài)和心肌纖維化改變。

1.4.5 大鼠心肌組織中Cx40、Cx43 的表達(dá)檢測對石蠟切片進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)、過氧化氫孵育、一抗孵育過夜、二抗孵育、DAB 溶液顯色、蘇木精復(fù)染、酸酒精分化、自來水藍(lán)化、脫水、中性樹膠封片、鏡檢等步驟完成免疫組織化學(xué)染色，觀察Cx40、Cx43的表達(dá)變化。

1.4.6 Western blotting 檢測大鼠心肌組織中Cx40、Cx43、α-SMA、OPN 的表達(dá)心肌組織提取蛋白后，經(jīng)制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗4℃孵育過夜、洗膜、二抗孵育、洗膜、顯色、曝光、采集圖像后分析結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism（Version 5）統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，方差分析的兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓的比較

3 組大鼠的尾動(dòng)脈收縮壓比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=241.800，P=0.038）。與WKY 組大鼠（99.150± 3.371）mmHg 比較，SHR 對照組尾動(dòng)脈壓（167.600± 2.117）mmHg 升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），SHR+ NaHS 組大鼠尾動(dòng)脈壓（107.900±1.175）mmHg 較SHR 對照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 NaHS 對SHR 尾動(dòng)脈收縮壓的影響 （n=8，±s）

2.2 各組大鼠外周血及心肌H2S 含量比較

3 組大鼠的外周血和心肌H2S 含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=764.300 和11.950，P=0.001 和0.008）。SHR 對照組大鼠外周血和心肌H2S 含量較WKY 組降低[（50.460±0.120）VS（53.920±0.243）μmol/L，（0.462±0.004）VS（0.508±0.004）μmol/g]（P＜0.05）；SHR+NaHS 組外周血及心肌中H2S 含量較SHR 對照組升高[（50.460±0.120）VS（59.070±0.003）μmol/L，（0.462±0.004）VS（0.538±0.018）μmol/g]（P＜0.05）。見圖2。

圖2 NaHS 對SHR 外周血和心肌中H2S 含量的影響 （n=8，±s）

2.3 各組大鼠心肌HE 染色及Masson 三色染色結(jié)果比較

HE 染色結(jié)果示W(wǎng)KY 組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，間距明顯，排列整齊，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整且排列規(guī)則，未見細(xì)胞變性和炎癥細(xì)胞浸潤；SHR 對照組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)排列紊亂堆積，細(xì)胞核破碎較多且排列紊亂，有炎癥細(xì)胞浸潤；SHR+NaHS 組大鼠心肌纖維排列較整齊，細(xì)胞核較完整且排列較規(guī)律。見圖3。

Masson 三色染色結(jié)果顯示，心肌中細(xì)胞核、膠原纖維和膠原蛋白染成藍(lán)色或綠色，細(xì)胞漿、肌肉和紅細(xì)胞染成紅色，SHR 對照組較WKY 組大鼠間質(zhì)藍(lán)色膠原纖維增多，NaHS 干預(yù)后間質(zhì)藍(lán)色膠原纖維有所減少。見圖3。

2.4 各組大鼠的Cx40、Cx43 表達(dá)情況

WKY 組大鼠的Cx40、Cx43 表達(dá)位置集中在心肌閏盤處，SHR 對照組大鼠的Cx40、Cx43 表達(dá)上調(diào)且在心肌表面隨機(jī)分布，不局限于心肌閏盤處；SHR+NaHS組與SHR 對照組比較，其Cx40、Cx43 蛋白表達(dá)有所減少且分布較有規(guī)律性。見圖4。

圖3 NaHS 對SHR 心肌纖維和細(xì)胞核的影響

2.5 各組大鼠心肌組織中Cx40、Cx43、α-SMA及OPN 的蛋白表達(dá)量的比較

WKY 組、SHR 對照組和SHR+NaHS 組大鼠心肌組織中Cx40、Cx43、α-SMA 及OPN 的蛋白表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與WKY 組大鼠比較，SHR 對照組Cx40、Cx43、α-SMA 及OPN 表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05），NaHS 干預(yù)后Cx40、Cx43、α-SMA及OPN 表達(dá)減弱（P＜0.05）。見表1 和圖5。

圖4 NaHS 對SHR 心肌中Cx40、Cx43 表達(dá)的影響 （免疫組織化學(xué)×400）

表1 NaHS 對SHR 心肌中Cx40、Cx43、α-SMA 和OPN 蛋白表達(dá)的影響 （n=8，±s）

表1 NaHS 對SHR 心肌中Cx40、Cx43、α-SMA 和OPN 蛋白表達(dá)的影響 （n=8，±s）

注：?與SHR 對照組比較，P＜0.05

組別 Cx40 Cx43 α-SMA OPN WKY 組 1.047±0.023? 0.983±0.008? 0.981±0.010? 0.995±0.003?SHR 對照組 1.458±0.013 1.158±0.013 1.165±0.010 1.082±0.001 SHR+NaHS 組 1.228±0.009? 0.919±0.004? 1.042±0.002? 0.854±0.012?F值 106.600 175.000 127.300 253.000P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖5 NaHS 對SHR 心肌中Cx40、Cx43、α-SMA 和OPN 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

心肌纖維化是多種心血管疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變，高血壓的長期刺激使心肌間質(zhì)的細(xì)胞數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)適應(yīng)性增生改變，產(chǎn)生間質(zhì)纖維化，是心肌缺血、心力衰竭、心肌梗死等心血管疾病的危險(xiǎn)因素[6-7]，心肌纖維化及心肌重構(gòu)存在于SHR 的整個(gè)高血壓階段，且隨著鼠齡的增加而逐漸加重[8]，本實(shí)驗(yàn)通過HE 染色及Masson 染色也證明SHR發(fā)生心肌纖維化及心肌重構(gòu)。心肌細(xì)胞中OPN 蛋白的過量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致心肌組織嚴(yán)重纖維化，心肌細(xì)胞斷裂變性，心室重構(gòu)的發(fā)生[9]；OPN 敲除可減輕Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化和心室重構(gòu)[10]；在大量生長因子和細(xì)胞因子的作用下，成纖維細(xì)胞表達(dá)大量的α-SMA并分泌大量的膠原蛋白，引起心臟纖維化，在梗死區(qū)可以檢測到大量α-SMA 表達(dá)，提示α-SMA 參與心肌梗死后心臟受損和心室重構(gòu)的過程[11]。以上研究表明，OPN、α-SMA 的蛋白表達(dá)量與心肌纖維化及心室重構(gòu)呈正相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)SHR 心肌中的OPN、α-SMA 表達(dá)升高，進(jìn)一步驗(yàn)證SHR 發(fā)生心肌纖維化及心肌重構(gòu)。

間隙連接是心肌細(xì)胞之間主要的連接方式，大多存在于閏盤處，在心血管系統(tǒng)中間隙連接蛋白的表達(dá)及功能異常與各種心血管疾病相關(guān)，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在缺血性心肌病、心肌肥厚及心力衰竭的發(fā)病過程中伴隨著間隙連接/Cx43 的重構(gòu)。據(jù)報(bào)道心房的快速起搏能誘發(fā)左心房組織心肌纖維化和Cx40 表達(dá)升高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)心房心肌纖維化的程度影響Cx40 的改變程度[12]；有研究表明，SHR 的心肌肥厚中Cx43 表達(dá)上調(diào)[2]；另有研究顯示，降低小鼠心室肌Cx43基因表達(dá)可增強(qiáng)纖維細(xì)胞的活化，導(dǎo)致心肌纖維化增多，提示恢復(fù)Cx43 功能也可能影響心肌重構(gòu)[13]。以上研究表明，間隙連接蛋白的表達(dá)與心肌纖維化之間存在不同的相關(guān)性，這可能與實(shí)驗(yàn)所取心臟的部位有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，SHR 心肌中Cx40、Cx43 蛋白表達(dá)升高，同時(shí)伴有心肌纖維化程度的增強(qiáng)，表明間隙連接蛋白的表達(dá)與心肌纖維化之間存在著密切的關(guān)系。

H2S 對維持心血管穩(wěn)態(tài)起關(guān)鍵性的作用[14]，有研究表明SHR 主動(dòng)脈H2S 的生成量低于WKY 組大鼠[15]，給予SHR 外源性H2S 可以降低大鼠動(dòng)脈血壓，且可減少心肌中膠原含量，進(jìn)而改善SHR 心肌中膠原的堆積，緩解心肌重構(gòu)[16-17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SHR 外周血及心肌組織中H2S 的含量低于WKY 組大鼠，NaHS 干預(yù)后H2S含量增加，同時(shí)NaHS 干預(yù)組大鼠的血壓降低，心肌組織中膠原堆積減少，心肌重構(gòu)得到抑制。有研究報(bào)道糖尿病大鼠心肌組織Cx43 在基因、蛋白水平上的表達(dá)均有不同程度下降，而H2S 可上調(diào)Cx43 mRNA 表達(dá)，提高Cx43 蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而改善細(xì)胞間的傳導(dǎo)[18]；H2S 可改善糖尿病大鼠心肌纖維化，同時(shí)上調(diào)Cx40 蛋白的表達(dá)，可能參與糖尿病大鼠的心肌纖維化和縫隙連接重構(gòu)的調(diào)控[19]。而本研究發(fā)現(xiàn)SHR 組心肌組織中Cx40、Cx43 蛋白表達(dá)較WKY 組大鼠增加，給予NaHS 可以降低Cx40、Cx43 的蛋白表達(dá)，同時(shí)可改善SHR 心肌重構(gòu)，因此推測H2S 可能是通過調(diào)控間隙連接蛋白的表達(dá)來緩解心肌重構(gòu)，但其機(jī)制尚不明確，近期研究發(fā)現(xiàn)H2S 可對特異蛋白進(jìn)行巰基化修飾，將某些功能蛋白（如KATP 通道、腺苷酸環(huán)化酶、MAPKs）中半胱氨酸殘基的-SH 轉(zhuǎn)變?yōu)?S-SH，從而使蛋白活性提高[20]；這種翻譯后修飾是機(jī)體實(shí)現(xiàn)心血管保護(hù)的重要機(jī)制[21]；且H2S 通過激活由鈣通道介導(dǎo)的AKT/eNOS/NO 通路來改善由L-NAME 誘導(dǎo)的高血壓性心臟病[3]，另外，H2S 可能通過TGF-β1/Smad 信號通路來抑制SHR 心肌中膠原合成[17]。因此，筆者推測H2S 可能是通過巰基化修飾來增強(qiáng)縫隙連接蛋白活性從而起到緩解心肌重構(gòu)的作用，同時(shí)也可能受上述信號通路的影響，然而這一推測有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。