趙秀娟，包翠芬，王琳，柳曉琳

（錦州醫(yī)科大學(xué) 1.公共衛(wèi)生學(xué)院，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，遼寧 錦州 121001）

鉻是一種常見(jiàn)的工業(yè)毒物和環(huán)境污染物，水中鉻主要以三價(jià)鉻和六價(jià)鉻為主[1]。研究表明，六價(jià)鉻的毒性比三價(jià)鉻毒性大100 倍[2]。鉻通過(guò)多種途徑進(jìn)入身體，在體內(nèi)蓄積后可以引發(fā)多種疾病，如潰瘍、黏膜炎等。肝臟是鉻的主要代謝器官之一[3]。為探討鉻污染區(qū)地下水對(duì)人群健康的影響，本研究分別用鉻污染區(qū)地下水及不同濃度重鉻酸鉀灌胃小鼠，觀察其對(duì)大鼠肝功能及肝細(xì)胞Caspase-3 和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase,PARP）表達(dá)的影響，探討鉻可能導(dǎo)致人體肝臟疾病及其損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取健康情況相近、SPF 級(jí)、同一批次的SD 孕鼠10 只，購(gòu)自錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（合格證號(hào)：SCXK 遼2014-0004）。于室溫（22±1）℃下喂養(yǎng)，相對(duì)濕度為50%～70%，室內(nèi)晝夜分明，實(shí)驗(yàn)期間小鼠可自由活動(dòng)、攝食及飲水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑重鉻酸鉀K2Cr2O7（分析純，含量≥ 99.8%，天津市華東試劑廠），鉻污染區(qū)地下水（錦州市金廠堡村張衛(wèi)東家深度18 ～20 m、鉻濃度為28.64 mg/L 地下水，由環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所檢測(cè)），鉻標(biāo)準(zhǔn)品（北京有色金屬研究總院），蘇木精-伊紅（HE）染色液（上海多烯公司），PARP 抗體、Cleaved Caspase-3（Asp 175）（Cell Signaling Technology 公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

7600-110 型全自動(dòng)生化分析儀（日本Hitxchi 公司），AAnalyst 800 原子吸收分光光度計(jì)（美國(guó)Perkin Elmer 公司），ST-60 型全自動(dòng)消解儀（北京普立泰科儀器有限公司），DK-8A 型電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），DHG-9240A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），BX41 型熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），TGL20M 型高速冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 慢性染毒試驗(yàn)將10 只SD 孕鼠隨機(jī)分成空白組、地下水組、低鉻組、中鉻組及高鉻組，每組2 只。分別灌胃蒸餾水、鉻含量為28.64 mg/L 的鉻污染區(qū)地下水，以及劑量為0.8、4.0 和20.0 mg/kg 的重鉻酸鉀溶液。母鼠共產(chǎn)仔76 只（5 組小鼠只數(shù)分別為15、17、14、17 和13 只），第21 天小鼠斷奶，直接灌胃，灌胃劑量不變（0.5 ml/100 g），1 次/d，灌胃期間小鼠自由進(jìn)食飲水，連續(xù)灌胃21 周。最后1 次灌胃后，禁食24 h 但不禁水。處死全部子代大鼠，采集肝臟組織及血液備用。

1.3.2 肝臟鉻含量的檢測(cè)將肝組織從-80℃冰箱中取出，用微量天平精確稱(chēng)量肝臟（0.40±0.03）g 于消解管中。在電腦軟件中設(shè)置消解管位置，再依次將消解管對(duì)應(yīng)放入消解儀中，按照設(shè)定條件進(jìn)行全自動(dòng)消解，同時(shí)做試劑空白，最后用去離子水定容至50 ml。將原子吸收儀設(shè)定為石墨爐法，調(diào)定肝臟鉻含量的檢測(cè)方法后，先繪制鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將所有樣品按照檢測(cè)方法中設(shè)定的位置依次對(duì)應(yīng)放入石墨爐中，檢測(cè)肝臟鉻的含量。

1.3.3 肝功能檢測(cè)染毒結(jié)束后，稱(chēng)量每只子代大鼠體重，2%戊巴比妥鈉（0.1 ml/100 g）腹腔注射。待其充分麻醉后，抽取腹主動(dòng)脈血，分裝在含有抗凝劑及非抗凝劑的采血管中。采血后，將含有抗凝劑的血樣置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將非抗凝劑采血管中的血樣靜置30 min 后放入離心機(jī)中，3 500 r/min，4℃離心10 min 后取出血清。用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總蛋白（total protein,TP）、白蛋白（Albumin,ALB）、球蛋白（Globulin,GLB）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的含量。

1.3.4 肝臟HE 染色解剖所有子代大鼠，取其肝臟組織，將一部分肝臟立即放入-80℃冰箱冷凍保存，另一部分放入配置好的10%甲醛溶液中固定。取出固定后的部分肝臟，經(jīng)自來(lái)水沖洗（2 h）、梯度濃度乙醇（由低到高）脫水、二甲苯透明、浸蠟（3 次，每次40 min）、石蠟包埋等步驟后，制作肝臟切片（厚度5 mm）。將制作好的肝臟切片經(jīng)二甲苯、梯度濃度乙醇（由高到低）脫蠟復(fù)水后HE 染色，中性樹(shù)膠封片并在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝臟Caspase-3 及PARP的表達(dá)制作肝臟石蠟切片，經(jīng)二甲苯透明，梯度濃度乙醇（由高到低）脫蠟復(fù)水后，再經(jīng)3% H2O2溫室孵育15 min，應(yīng)用高壓抗原修復(fù)法，滴加5 % BSA 封閉血清溫室孵育30 min，滴加一抗后放入4℃溫室孵育20 h。次日滴加二抗，37℃孵育30 min 后滴加DAB顯色，待鏡下觀察反應(yīng)充分后放入雙蒸水中終止反應(yīng)。最后HE 復(fù)染，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片觀察Caspase-3 及PARP 的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子代大鼠肝臟鉻含量的比較

地下水和重鉻酸鉀染毒子代大鼠肝臟鉻含量的變化顯示，與空白組比較，地下水組與各劑量重鉻酸鉀染毒組肝臟中鉻的含量均升高，且隨著染毒劑量的升高，子代大鼠肝臟中鉻含量呈上升趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。地下水組肝臟鉻含量與低鉻組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 子代大鼠肝功能化驗(yàn)結(jié)果的比較

地下水和重鉻酸鉀染毒子代大鼠血清TP、ALB、GLB 含量和AST、ALT、ALP 活力的變化顯示，與空白組比較，地下水組與各劑量重鉻酸鉀染毒組血清TP、ALB、GLB 的含量均升高，中鉻組和高鉻組各血清指標(biāo)與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。地下水組與各劑量重鉻酸鉀染毒組血清AST、ALT、ALP 活力均高于空白組，各劑量重鉻酸鉀染毒組與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表1 子代大鼠肝臟鉻含量的比較 （μg/L，±s）

表1 子代大鼠肝臟鉻含量的比較 （μg/L，±s）

注：1）與空白組比較，P＜0.05；2）與地下水組比較，P＜0.05；3）與低鉻組比較，P＜0.05；4）與中鉻組比較，P＜0.05

組別 n鉻含量空白組 15 13.20±0.71地下水組 17 14.85±2.251）低鉻組 14 15.72±1.061）中鉻組 17 19.77±1.401）2）3）高鉻組 13 53.30±3.471）2）3）4）F值 979.310P值 0.001

表2 子代大鼠肝功能化驗(yàn)結(jié)果的比較 （±s）

表2 子代大鼠肝功能化驗(yàn)結(jié)果的比較 （±s）

注：1）與空白組比較，P＜0.05；2）與地下水組比較，P＜0.05；3）與低鉻組比較，P＜0.05；4）與中鉻組比較，P＜0.05

組別 nTP/（g/L）ALB/（g/L）GLB/（g/L）AST/（u/L）ALT/（u/L）ALP（u/L）空白組 15 51.99±3.57 27±1.25 24.27±1.16 61.53±6.09 25.47±2.30 49.73±7.45地下水組 17 52.67±6.60 29.24±3.07 25.76±2.97 70.59±7.96 29.24±4.41 63.59±1.53低鉻組 14 53.71±6.19 29.50±4.43 26.36±3.75 72.36±3.931）2） 30.93±3.241）2） 65.64±7.241）2）中鉻組 17 60.33±5.071）2）3） 34.59±2.031）2）3） 30.71±2.841）2）3） 91.24±12.351）2）3） 39.24±8.491）2）3） 75.65±12.771）2）3）高鉻組 13 70.31±4.591）2）3）4） 36.92±4.521）2）3）4） 34.69±2.171）2）3）4） 125.15±25.841）2）3）4） 58.77±18.661）2）3）4） 97.54±13.071）2）3）4）F值 28.919 32.439 34.699 42.732 29.475 37.719P值 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001

2.3 子代大鼠肝臟HE 染色結(jié)果

熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)空白組肝細(xì)胞排列整齊，呈條索狀，細(xì)胞質(zhì)圓潤(rùn)飽滿。地下水組肝細(xì)胞出現(xiàn)嗜酸性樣改變且排列不規(guī)則。隨著重鉻酸鉀染毒濃度增加肝細(xì)胞表現(xiàn)為不同程度的嗜酸性樣變，排列紊亂，細(xì)胞質(zhì)間隙加大，甚至呈現(xiàn)空泡性樣變。少數(shù)高鉻組出現(xiàn)肝竇擴(kuò)張，淤血及少量滲出性出血，偶見(jiàn)壞死灶。見(jiàn)圖1。

2.4 肝臟組織Caspase-3 及PARP 表達(dá)

熒光顯微鏡下可觀察空白組肝細(xì)胞排列規(guī)則，Caspase-3 及PARP 陽(yáng)性細(xì)胞少見(jiàn)。地下水組可見(jiàn)肝細(xì)胞胞質(zhì)充盈度增加，可見(jiàn)少許陽(yáng)性細(xì)胞。隨著重鉻酸鉀染毒濃度增加，肝細(xì)胞排列逐漸稀疏紊亂，陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多。見(jiàn)圖2、3。

圖1 子代大鼠肝臟組織病理改變 （HE×400）

圖2 子代大鼠肝臟組織Caspase-3 表達(dá) （免疫組織化學(xué)×400）

圖3 子代大鼠肝臟組織PARP 表達(dá) （免疫組織化學(xué) ×400）

3 討論

肝臟是鉻的主要代謝器官之一，攝入過(guò)多的鉻可以導(dǎo)致肝臟受損，甚至?xí)掳4]。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期居住在鉻污染區(qū)的居民惡性腫瘤發(fā)病率明顯高于其他地區(qū)[5]。血清學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)對(duì)檢查肝臟疾病具有十分重要的作用。TP 可分為ALB 和GLB 兩類(lèi)，在機(jī)體中具有維持血液正常膠體滲透壓和pH 值、運(yùn)輸多種代謝物、免疫作用等多種功能。GLB 升高，可引起慢性炎癥、感染及免疫系統(tǒng)等疾病。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，地下水組與鉻染毒組TP、ALB、GLB 的含量均高于空白組；隨著染毒劑量的升高，大鼠血清TP、ALB、GLB 的活力呈上升趨勢(shì)。這說(shuō)明六價(jià)鉻能夠造成血清蛋白含量發(fā)生變化，且鉻劑量越高效果越明顯。

反映肝細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志物包括ALT、AST[3]和ALP。ALT 主要存在于肝臟、心臟組織細(xì)胞中，AST 主要分布在心肌、肝臟、骨骼肌和腎臟等組織中。ALP是廣泛分布于肝臟、骨骼、腸、腎等組織中，通常輔助ALT 鑒別肝膽疾病。正常情況下，血液中的ALT 和AST 含量較低，但當(dāng)相應(yīng)組織細(xì)胞受損時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，會(huì)使胞漿內(nèi)的ALT 和AST 釋放入血，從而導(dǎo)致血清濃度升高。劉學(xué)慧等[6]發(fā)現(xiàn)灌溉污水可對(duì)大鼠肝細(xì)胞造成損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，地下水組與鉻染毒組AST、ALT 和ALP 的活性均增高；但地下水組與低鉻組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨著染毒劑量升高，大鼠血清AST、ALT 和ALP 活性呈上升趨勢(shì)。該結(jié)果與陳佳等[7]研究結(jié)果相符，這說(shuō)明六價(jià)鉻染毒能夠造成大鼠肝功能損傷，鉻在肝臟內(nèi)蓄積后可以干擾或破壞肝細(xì)胞生長(zhǎng)，且鉻劑量越高肝功能損傷越嚴(yán)重。

與空白組比較，地下水組與重鉻酸鉀染毒組肝臟中鉻的含量均有增長(zhǎng)，且隨著鉻濃度增加，除地下水組與低鉻組外，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說(shuō)明鉻在肝臟內(nèi)有蓄積作用。

HE 染色結(jié)果顯示，隨著重鉻酸鉀染毒濃度增加，肝細(xì)胞表現(xiàn)為不同程度的嗜酸性樣變，肝索排列逐漸紊亂；部分肝細(xì)胞質(zhì)間隙加大，核濃縮且偏移；部分肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡性樣變；少數(shù)出現(xiàn)脂肪性樣變。陳佳等[7]發(fā)現(xiàn)用高劑量1/2 LD 50（85.5 mg/kg）重鉻酸鉀溶液灌胃小鼠35 d 后，肝細(xì)胞之間有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肝細(xì)胞組織出現(xiàn)大片細(xì)胞液化壞死，甚至出現(xiàn)細(xì)胞核碎裂、溶解。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)該結(jié)果很可能是由于重鉻酸鉀染毒劑量差異導(dǎo)致。由此說(shuō)明鉻不僅可以在短期內(nèi)對(duì)肝臟產(chǎn)生中毒效應(yīng)，也可以產(chǎn)生蓄積作用，干擾肝細(xì)胞正常代謝，導(dǎo)致細(xì)胞器功能受損，且蓄積時(shí)間越長(zhǎng)，鉻劑量越高，肝功能損傷越明顯。

Caspase-3 是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，PARP 酶是細(xì)胞凋亡核心成員半胱天冬酶（Caspase）的切割底物，PARP 失去酶活力會(huì)加速細(xì)胞的不穩(wěn)定，它們?cè)贒NA 損傷修復(fù)與細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。有學(xué)者在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)Cr（Ⅵ）可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡[8]。本實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，隨著重鉻酸鉀染毒濃度增加，肝細(xì)胞排列逐漸稀疏紊亂，陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多。由此說(shuō)明鉻在肝臟內(nèi)蓄積后能夠使Caspase-3 活性增強(qiáng)，PARP 失去活性，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡。

綜上所述，六價(jià)鉻長(zhǎng)期暴露對(duì)大鼠的肝功能造成一定損傷并且對(duì)血清生化指標(biāo)產(chǎn)生影響。但是具體通過(guò)哪種通路發(fā)揮作用尚未可知，有待更深入研究。由于鉻污染區(qū)地下水組與低鉻組各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果相仿，因此推斷，長(zhǎng)期飲用鉻污染區(qū)地下水可能對(duì)肝臟造成一定損傷。眾多調(diào)查顯示，鉻污染區(qū)居民慢性病及腫瘤發(fā)病率明顯高于其他地區(qū)，建議當(dāng)?shù)卣扇∮行Т胧乐广t污染的發(fā)生。