張 欣,張偉偉,張 燕,石曉玉,孫紫薇,劉 昆,張國(guó)營(yíng)

(煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院分子藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室,煙臺(tái)大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺(tái)大學(xué)),山東 煙臺(tái) 264005)

黑色素瘤是易轉(zhuǎn)移、侵襲力強(qiáng)且惡性程度較高的一類腫瘤[1],發(fā)病率逐年上升,生存期短,使人類的生命健康受到極大地威脅．目前對(duì)黑色素瘤的醫(yī)治以化療和生物療法為主,但化療藥物強(qiáng)烈的毒副作用使患者的依從性較差,生物療法雖然在一定程度上優(yōu)于化療,卻并不能延伸患者生命和提升生活質(zhì)量[2]．除此之外,靶向治療、電化學(xué)療法和免疫治療藥物的聯(lián)合療法等也正在研究之中,但還有很大的改進(jìn)空間[3]．因此亟需尋找一種治療效果優(yōu)、毒副作用低的藥物用于抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)和遷移．

茶氨酸是從茶葉中提取的一種化合物,具有鎮(zhèn)靜、增強(qiáng)免疫、抑制腫瘤生長(zhǎng)等藥理活性,在抗腫瘤方面其單獨(dú)用藥也可對(duì)多種癌癥細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)揮一定的抑制作用[4]．本實(shí)驗(yàn)室在茶氨酸的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行改造,制成了具有更強(qiáng)的藥理活性的化合物茶溴香酰胺(TBrC),化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示．但是由于其口服生物利用度差,所以對(duì)其進(jìn)行劑型改進(jìn),合成了茶溴香酰胺脂質(zhì)體(TBrC-L),前期初步研究顯示其對(duì)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移具有抑制作用[5]．本研究重點(diǎn)聚焦TBrC-L體外對(duì)黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的影響與其作用的分子機(jī)制,為進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和研發(fā)抗黑色素瘤新藥提供科學(xué)依據(jù)．

圖1 TBrC化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 黑色素瘤B16細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞所;胎牛血清(FBS)、雙抗溶液和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國(guó)Hyclone 公司;NF-κB抑制劑Bay11-7082(Bay)購自碧云天生物技術(shù)研究所;BCA工作液、臺(tái)盼藍(lán)染色液、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Hoechst33258熒光染料、c-Met、HGF、Bcl-2、NF-κB、VEGFR2、Caspase-3、E-cadherin、Bax、p53和Cytochrome c抗體、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠和抗兔購自美國(guó)Cell Signaling Technology Inc. 公司．TBrC-L由本實(shí)驗(yàn)室依據(jù)之前已經(jīng)發(fā)表的方法[5]制備．

1.1.2 儀器 3111型二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司);離心機(jī)(Eppendorf公司);TE2000-U型倒置熒光顯微鏡(Nikon公司);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Bio-tek公司);小型垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)移槽(BIO-RAD公司)．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將黑色素瘤B16細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(提前加入10%FBS、1%的雙抗混合液),將其置于37 ℃恒溫常規(guī)培養(yǎng)．待細(xì)胞貼壁后根據(jù)細(xì)胞密度及狀態(tài)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)．

1.2.2 MTT法檢測(cè)TBrC-L對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 參考之前已有的試驗(yàn)方法[6],在無菌環(huán)境下,胰酶消化細(xì)胞后收集,再將其制成細(xì)胞懸液,在96孔板中每孔接種2 000個(gè)細(xì)胞,24 h后分組加藥,每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔,分別加入2 μL濃度為16、64、125、250 μmol·L-1的TBrC-L、2 μmol·L-1的Bay以及空白對(duì)照．加藥后置于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng),至48 h和72 h時(shí)取出,每孔加入提前配置好的MTT溶液10 μL,作用4 h后棄上清液,加入150 μL的DMSO溶解甲瓚晶體,置于搖床震動(dòng)15 min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)(檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為570 nm,參考波長(zhǎng)為630 nm)．根據(jù)吸光度計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)率．

1.2.3 細(xì)胞劃痕術(shù)評(píng)估TBrC-L對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞遷移的影響 用已滅菌的記號(hào)筆和直尺在六孔板背面畫5條平行直線,將細(xì)胞按常規(guī)方法收集,并按照每孔5×105個(gè)種于六孔板后置于培養(yǎng)箱．培養(yǎng)過夜后用移液槍槍頭垂直于板背面的線進(jìn)行劃痕,PBS洗滌2次后拍照．加入2 mL DMEM(無FBS),依次加入16、64、125、250 μmol·L-1的TBrC-L、2 μmol·L-1的Bay以及空白對(duì)照,作用12 h后棄去培養(yǎng)液,PBS稍加清洗后拍照．對(duì)遷移到劃痕處的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)．相對(duì)細(xì)胞遷移率(%)=給藥組劃痕處細(xì)胞數(shù)量/空白對(duì)照組劃痕處細(xì)胞數(shù)量×100%．

1.2.4 Hoechst 33258染色法觀察藥物作用下細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化 參考已報(bào)道的方法稍加優(yōu)化[7-8],培養(yǎng)黑色素瘤B16細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,常規(guī)方法處理至濃度為5×105個(gè)/mL,并以1 mL/孔種于六孔板,24 h后取出,PBS沖洗2次后加入培養(yǎng)液并加入TBrC-L、Bay以及空白對(duì)照,作用48 h后,棄培養(yǎng)液,加入冷固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1),置冰上10 min后棄去上清液,用冷的PBS洗滌3次,加入Hoechst 33258染色液(10 μg/mL),隨即放冰上15 min使其充分染色,染色完成后用PBS洗滌,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照．

1.2.5 Western Blotting檢測(cè)TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞中與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 基于報(bào)道的方法[9],對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)．首先用之前所述的不同濃度的TBrC-L、Bay作用于B16細(xì)胞48 h,將細(xì)胞刮下收集至EP管中,3 000 r/min離心4 min,棄上清,視細(xì)胞數(shù)量加入RIPA裂解液(提前加入PMSF),低溫裂解15 min,裂解后將細(xì)胞在低溫下進(jìn)行超聲破碎,用12 000 r/min離心6 min,用BCA法檢測(cè)并計(jì)算蛋白濃度,以50 μg的上樣量求得上樣體積．按順序?qū)㈩A(yù)染好的Marker和分裝好的蛋白加入樣品槽,記錄上樣順序,接通電源,用SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白按照分子質(zhì)量分離出來,然后將蛋白轉(zhuǎn)至用甲醇活化好的PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜后TBST洗3次,每次5 min,用7%的脫脂奶粉封閉,置于搖床上晃動(dòng)2 h,按說明書封一抗并放在4 ℃過夜,第二天洗滌后封二抗,孵育1 h后洗滌3次,然后進(jìn)行ECL顯色,按序進(jìn)行顯影、定影,然后根據(jù)條帶面積及曝光度軟件分析計(jì)算相對(duì)蛋白表達(dá)水平,以GAPDH作為內(nèi)參分析所檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平．

本實(shí)驗(yàn)中均采用NF-κB抑制劑Bay為陽性對(duì)照,是由于NF-κB在大多數(shù)腫瘤都是高激活狀態(tài),參與調(diào)控與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,被認(rèn)為是最重要的原癌基因之一[10],NF-κB的組成性活化是黑色素瘤的標(biāo)志之一[11],因此,抑制NF-κB的活性是治療黑色素瘤的關(guān)鍵位點(diǎn)之一．故本實(shí)驗(yàn)以NF-κB抑制劑Bay為陽性對(duì)照,評(píng)估TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移的影響及其分子機(jī)制．

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 TBrC-L對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

如圖2所示,MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,16～250 μmol·L-1的TBrC-L均能對(duì)B16細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生不同程度的抑制作用,在藥物濃度遞增過程中,其抑制作用也逐漸加強(qiáng),藥物作用72 h時(shí)產(chǎn)生的抑制作用顯著優(yōu)于48 h．?dāng)?shù)據(jù)顯示,250 μmol·L-1的TBrC-L在48 h和72 h分別能產(chǎn)生63%及80%的抑制效果,高劑量的TBrC-L甚至可以產(chǎn)生比陽性對(duì)照NF-κB抑制劑Bay稍強(qiáng)的抑制作用．

2.2 TBrC-L對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3,在劃痕后12 h時(shí),空白對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)量較多,說明B16細(xì)胞具有很強(qiáng)的遷移能力,不同濃度給藥組表現(xiàn)出了顯著的抑制遷移的作用,高濃度的TBrC-L相對(duì)遷移率為36.17%,而陽性對(duì)照Bay組的相對(duì)遷移率為47.2%,表現(xiàn)出稍優(yōu)于陽性對(duì)照組的抑制作用．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TBrC-L可對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞的遷移發(fā)揮顯著的抑制作用．

2.3 TBrC-L對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞凋亡的影響

通過Hoechst 33258染色法評(píng)估TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞產(chǎn)生的凋亡作用,結(jié)果如圖4所示.熒光顯微鏡下,空白對(duì)照組細(xì)胞均勻分布,細(xì)胞形態(tài)完整,而藥物作用下的細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生了變化,如細(xì)胞核濃縮,染色質(zhì)聚集、邊緣化,出現(xiàn)凋亡小體等．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TBrC-L可對(duì)B16細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生誘導(dǎo)作用．高濃度的TBrC-L作用下,細(xì)胞的凋亡率為29%,陽性對(duì)照Bay組的細(xì)胞凋亡率為26%.

2.4 TBrC-L對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4.1 TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)的影響 如圖5所示,在TBrC-L的作用下B16細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)水平顯著升高,且藥物濃度增加,p53蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)．高、低濃度藥物作用下分別上調(diào)2.3和1.3倍．陽性對(duì)照NF-κB抑制劑Bay也增加了p53蛋白的表達(dá),上調(diào)了2.5倍．

2.4.2 TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響 由圖6可知,高低濃度的TBrC-L 作用于B16 細(xì)胞后,Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低,而Bax表達(dá)量增多,所以Bcl-2/Bax值變小,16、250 μmol·L-1的TBrC-L分別使比值下調(diào)60%和78%,陽性對(duì)照Bay使其下降了81%．

圖4 TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞凋亡的影響與空白對(duì)照組相比,***P<0.001)

圖5 TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比,***P<0.001)

圖6 TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比,***P<0.001)

2.4.3 TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞中胞漿細(xì)胞色素C(cy c)蛋白水平的影響 TBrC-L作用于B16細(xì)胞48 h后,胞漿中細(xì)胞色素C水平顯著提高,高低濃度藥物處理后,其胞漿蛋白水平分別提高了2.6和1.6倍,陽性對(duì)照Bay組提高了2.5倍．結(jié)果見圖7．

2.4.4 TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 如圖8所示,B16細(xì)胞中Caspase-3蛋白在高低濃度的TBrC-L作用下其表達(dá)量均顯著上調(diào),與未用藥組相比分別上調(diào)8倍和5倍,陽性對(duì)照Bay組也上調(diào)7.9倍．

2.4.5 TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞中HGF蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果如圖9所示,在TBrC-L 48 h作用下,細(xì)胞中的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF蛋白表達(dá)水平顯著降低, 與空白對(duì)照組相比, 高低濃度的TBrC-L分別使其下調(diào)了51%和26%,根據(jù)結(jié)果可知,隨著藥物濃度增高,HGF蛋白的表達(dá)量下調(diào)更顯著．陽性對(duì)照Bay組,使其下調(diào)57%．

圖7 TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞中胞漿細(xì)胞色素C蛋白水平的影響與對(duì)照組相比,***P<0.001)

圖8 TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比,***P<0.001)

圖9 TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞中HGF蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比,***P<0.001)

2.4.6 TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞中c-Met蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果如圖10所示,16 μmol·L-1和250 μmol·L-1的TBrC-L均可下調(diào)B16細(xì)胞中c-Met受體蛋白的表達(dá)水平,與未給藥組相比,高低濃度的TBrC-L分別使其下調(diào)了58%和37%,陽性對(duì)照組使其下調(diào)了56%,可見,高濃度的TBrC-L對(duì)c-Met蛋白表達(dá)的影響甚至稍優(yōu)于陽性對(duì)照Bay組．

圖10 TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞中c-Met受體蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比,***P<0.001)

2.4.7 TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示,TBrC-L作用于B16細(xì)胞后可顯著下調(diào)NF-κB蛋白的表達(dá)水平,由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見,16、250 μmol·L-1的TBrC-L分別使其表達(dá)量下調(diào)了29%和54%,陽性對(duì)照Bay組使其下調(diào)了56%．

圖11 TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比,***P<0.001)

2.4.8 TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞中VEGFR2蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示,兩濃度作用下,B16細(xì)胞內(nèi)VEGFR2受體蛋白的表達(dá)水平顯著降低,16、250 μmol·L-1的TBrC-L分別使其表達(dá)量下調(diào)了34%和51%,陽性對(duì)照Bay組使其下調(diào)了54%．

2.4.9 TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖13所示,不同濃度的TBrC-L作用于B16細(xì)胞后,E-cadherin蛋白表達(dá)量上調(diào),與空白對(duì)照組相比,高低濃度藥物作用下其表達(dá)量分別上調(diào)了1.4倍和2倍,陽性對(duì)照Bay組使其上調(diào)了1.9倍．

3 討論與結(jié)論

TBrC是本實(shí)驗(yàn)室由茶氨酸修飾而得,并進(jìn)一步合成TBrC-L,大大改善了生物利用度,使其抗癌作用效果顯著提高．本研究結(jié)果提示,TBrC-L在黑色素瘤B16細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移方面均可發(fā)揮較強(qiáng)的抑制作用,可促進(jìn)B16細(xì)胞的凋亡,通過Western blotting實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步了解其抗黑色素瘤的分子機(jī)制,初步明確其對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞中與腫瘤生長(zhǎng)、遷移和凋亡相關(guān)蛋白的影響．

圖12 TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞中VEGFR2受體蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比,***P<0.001)

圖13 TBrC-L對(duì)B16細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比,***P<0.001)

細(xì)胞的凋亡過程受到許多相關(guān)蛋白的嚴(yán)格控制． Bcl-2家族蛋白[12]在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著不容小覷的作用,其中Bcl-2可促進(jìn)細(xì)胞增殖,減少凋亡的產(chǎn)生,Bax蛋白可與其結(jié)合,產(chǎn)生異構(gòu)二聚體,影響B(tài)cl-2蛋白的表達(dá),使其抑制細(xì)胞凋亡的作用大大削減,Bax蛋白的作用卻會(huì)加強(qiáng),二者結(jié)合可加速細(xì)胞凋亡,二者比值的平衡性在細(xì)胞凋亡過程中也至關(guān)重要,它決定了細(xì)胞凋亡與否,并且影響細(xì)胞凋亡的閾值[13]． 抑癌因子p53蛋白在細(xì)胞周期中可發(fā)揮調(diào)控作用,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的DNA遭破損時(shí),p53蛋白可根據(jù)其損傷程度給予修復(fù)或促進(jìn)其凋亡[11-15]． p53的激活還可觸發(fā)包括Bax在內(nèi)的促凋亡基因的激活,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[16]．Bcl-2與Bax比值的變化還可引起線粒體膜通透性的增強(qiáng),從而釋出細(xì)胞色素C,胞漿中細(xì)胞色素C的增多可間接激活半胱天冬酶(Caspase-3)[17]．Caspase-3活化后,便可發(fā)揮很強(qiáng)的促細(xì)胞凋亡的作用,它可以通過裂解DNA損傷相關(guān)修復(fù)因子、抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)分子等發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[18]．本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),TBrC-L可顯著下調(diào)Bcl-2的表達(dá),上調(diào)Bax的表達(dá),使Bcl-2/Bax值降低,并且使細(xì)胞色素C表達(dá)水平上調(diào),進(jìn)而增加Caspase-3的表達(dá),加速腫瘤細(xì)胞的凋亡．

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)及其受體Met可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能,包括生長(zhǎng)、增殖、遷移和形態(tài)等[19]．HGF作為細(xì)胞中重要的活性因子擁有復(fù)雜的生物活性,在免疫調(diào)節(jié)、血管生成等方面都有著至關(guān)重要的作用,它可以參與細(xì)胞有絲分裂、促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[20]．原癌基因編碼的c-Met蛋白是一種跨膜受體,可以通過自身反應(yīng)完成磷酸化[21]．當(dāng)HGF與c-Met結(jié)合后,促進(jìn)酪氨酸殘基磷酸化,進(jìn)而刺激細(xì)胞內(nèi)其他信號(hào)通路產(chǎn)生活性,最終引起腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲．本實(shí)驗(yàn)研究中,TBrC-L可顯著下調(diào)HGF和c-Met蛋白的表達(dá),在B16細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移方面發(fā)揮了顯著性抑制作用．

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是REL蛋白家族的一員,存在形式通常是二聚體,未被激活時(shí)與其抑制底物 IκB存在于細(xì)胞質(zhì)之中,一經(jīng)激活,便迅速進(jìn)入胞核,作用于凋亡基因調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,遏抑細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[22]．其次NF-κB還能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá),研究表明,應(yīng)激機(jī)制通過VEGF在腫瘤細(xì)胞中的分泌刺激腫瘤血管生成,血管新生在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵性的作用, 且與預(yù)后不良密切相關(guān)[23]．VEGFR2是VEGF非常重要的受體之一[24],二者結(jié)合后,在促進(jìn)血管生成方面的能力顯著增強(qiáng),可加速腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移．此外,有研究表明,NF-κB與上皮型鈣粘蛋白(E-cadherin)也有著千絲萬縷的關(guān)系,若將NF-κB信號(hào)通路阻斷,E-cadherin的表達(dá)也會(huì)受到影響,而E-cadherin的缺失或低表達(dá)又可以刺激NF-κB通路產(chǎn)生活性[25]．E-cadherin在正常細(xì)胞間的黏連和信號(hào)傳導(dǎo)方面發(fā)揮著不可或缺的作用,若E-cadherin表達(dá)下降,那么細(xì)胞間粘附和細(xì)胞連接的喪失使細(xì)胞與原始腫瘤分離,侵襲周圍組織,并遷移到遠(yuǎn)處[26]． 這類蛋白還可對(duì)細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路的活性產(chǎn)生一定的影響,如MAPK、PI3K、NF-κB等信號(hào)通路[27]．TBrC-L可顯著下調(diào)NF-κB和VEGFR2的表達(dá),并誘導(dǎo)E-cadherin蛋白的表達(dá),從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和轉(zhuǎn)移的效果．

綜上所述,TBrC-L可有效地抑制黑色素瘤B16細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡,其作用的分子機(jī)制可能與HGF/Met/VEGFR2-NF-κB信號(hào)通路有關(guān)．本研究在黑色素瘤的醫(yī)治方面提供了新的線索,進(jìn)一步確認(rèn)了TBrC-L開發(fā)為抗癌新藥的潛力．但是本實(shí)驗(yàn)中TBrC-L對(duì)黑色素瘤的作用仍處于體外研究階段,由于體外和體內(nèi)環(huán)境差異較大,后續(xù)研究將進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),以證實(shí)體外實(shí)驗(yàn)和脂質(zhì)體制劑的體內(nèi)靶向性及其生物利用度,TBrC-L實(shí)現(xiàn)黑色素瘤的靶向治療效果和作用機(jī)制值得進(jìn)一步的深入研究．