王學(xué)凱,李 新,冀 凱,劉 悅,杜世豪,岳 光,齊 棟,范華英

(1.煙臺大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評價教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺大學(xué)),山東 煙臺 264005;2.煙臺市毓璜頂醫(yī)院腎內(nèi)科,山東 煙臺 264000)

微小病變型腎病(minimal change disease, MCD)是臨床中最為常見的腎病綜合征的一種病理類型,是導(dǎo)致腎小球疾病的常見病因之一[1]．MCD臨床特征以大量蛋白尿、低白蛋白血癥以及高脂血癥為主[2],目前主要以糖皮質(zhì)激素類藥物治療,但大劑量或長時間使用糖皮質(zhì)激素類藥物常常伴有嚴(yán)重的不良反應(yīng)[2]．因此,尋找新的策略以改善現(xiàn)有治療的療效并減少其不良反應(yīng)具有重要的臨床價值．

目前,MCD的具體發(fā)病機(jī)制仍然不清楚．研究表明,MCD是多系統(tǒng)參與的疾病．近年來,炎癥和氧化應(yīng)激已經(jīng)被證明在MCD的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3-6]．研究發(fā)現(xiàn),MCD發(fā)病時,循環(huán)血液中促炎性細(xì)胞因子如血清白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)等急性時相反應(yīng)蛋白水平增高[7],這些炎癥介質(zhì)可能參與或加重腎臟的損害,也可誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子如白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)的產(chǎn)生和釋放,進(jìn)一步促進(jìn)炎癥的發(fā)生和發(fā)展,加重病情[8]．此外,氧化應(yīng)激也是MCD腎臟損傷的發(fā)生和發(fā)展中的重要因素．機(jī)體產(chǎn)生的過量活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)破壞腎小球基底膜的完整性或減少足細(xì)胞粘蛋白的合成,導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障的破壞[9]．因此,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),改善氧化應(yīng)激狀態(tài)對于改善MCD的病變有著積極的作用．

基于MCD的復(fù)雜發(fā)病機(jī)制,多藥聯(lián)合在MCD的治療中可能有著重要的優(yōu)勢．丹酚酸A(圖1)是臨床廣泛用于腎病治療的中藥丹參的提取物[10],是丹參水溶物中含量最多的多酚類之一,也是丹參提取物中抗氧化能力最強(qiáng)的一種化合物[11],有著很好的成藥性[12]．經(jīng)研究,丹酚酸A有很多藥理活性,如抗炎[13]、抗氧化[14]、抗血小板聚集[15]等,且研究發(fā)現(xiàn),丹酚酸A在多種腎臟疾病中都具有保護(hù)作用[11,16-17]．因此,基于丹酚酸A的藥理活性與MCD病理生理的聯(lián)系,本研究利用阿霉素誘導(dǎo)的MCD模型評價丹酚酸A聯(lián)合低劑量潑尼松對實(shí)驗(yàn)性MCD大鼠模型的保護(hù)作用,為丹酚酸A在臨床MCD治療中的開發(fā)和應(yīng)用提供基礎(chǔ)．

圖1 丹酚酸A結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性成年SD(Sprague-Dawley)大鼠(體重175±5 g)48只,購自山東省濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司,實(shí)驗(yàn)動物合格證No.0003609,許可證號:SCXK(魯)2014007．所有實(shí)驗(yàn)用大鼠均在溫度為24±1 ℃和濕度為55%±5%的條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,并給予自由飲食和飲水．本研究經(jīng)過煙臺大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)方案符合煙臺大學(xué)動物倫理委員會的規(guī)定．

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 透射電子顯微鏡(日本電子株式會社),全自動生化分析儀(上海安亭科學(xué)儀器廠),TGL-16G臺式高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),-80 ℃超低溫冰箱(青島海爾股份有限公司),多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)．

1.1.3 藥品與試劑 丹酚酸A(純度≥98%)由山東靶點(diǎn)藥物研究有限公司提供;潑尼松來源于浙江仙琚制藥股份有限公司;阿霉素購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司;IL-1β測試盒、IL-6測試盒、TNF-α測試盒、CRP測試盒來自于廈門慧嘉生物科技有限公司;大鼠血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)測定試劑盒來自于南京建成科技有限公司;大鼠血清丙二醛(malonaldehyde, MDA)檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒來源于碧云天生物技術(shù)有限公司．

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組 健康雄性成年SD大鼠48只,隨機(jī)分為6組:空白對照組、模型組、高劑量潑尼松組、低劑量潑尼松組、丹酚酸A組、丹酚酸A+低劑量潑尼松組,每組8只．

1.2.2 實(shí)驗(yàn)造模及給藥 參考相關(guān)文獻(xiàn)[18],通過單次尾靜脈注射阿霉素(7.5 mg/kg,溶于0.9%氯化鈉溶液)制備MCD大鼠模型,空白對照組大鼠注射等容量的0.9%氯化鈉水溶液,造模當(dāng)日記為第 1天．第7天開始給予藥物干預(yù):(1)空白對照組:給予等劑量的0.9%氯化鈉溶液灌胃及5%葡萄糖溶液尾靜脈注射;(2)模型組:給予等劑量的0.9%氯化鈉溶液灌胃及5%葡萄糖溶液尾靜脈注射;(3)高劑量潑尼松組:以0.9%氯化鈉溶液為溶媒配制潑尼松溶液,按照10 mg/kg的給藥劑量通過灌胃給藥,同時給予等劑量5%葡萄糖溶液尾靜脈注射;(4)低劑量潑尼松組:以0.9%氯化鈉溶液為溶媒配制潑尼松溶液,按照5 mg/kg的給藥劑量通過灌胃給藥,同時給予等劑量5%葡萄糖溶液尾靜脈注射;(5)丹酚酸A組:以5%葡萄糖溶液為溶媒配制丹酚酸A溶液,按照10 mg/kg的給藥劑量通過尾靜脈給藥,同時給予等劑量0.9%氯化鈉溶液灌胃;(6)丹酚酸A+低劑量潑尼松組:給予5 mg/kg的潑尼松灌胃給藥以及10 mg/kg的丹酚酸A尾靜脈給藥．所有藥物均為每日單次給藥,連續(xù)給藥21 d．

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 24 h尿蛋白含量檢測 實(shí)驗(yàn)期間,利用代謝籠收集大鼠第3、7、14、21、28天24 h尿液,收集尿液期間對大鼠禁食不禁水．收集的尿液在1 000×g的離心力下離心15 min,取上清液進(jìn)行尿蛋白含量檢測．尿蛋白含量利用BCA蛋白定量試劑盒檢測,實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行,最后,計(jì)算樣本中蛋白含量．

1.3.2 血生化指標(biāo)檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時,從腹主動脈取血8 mL,室溫下靜置2 h后,在1 000×g的離心力下離心15 min,取上清液即為血清．利用全自動生化分析儀檢測血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)．

1.3.3 電鏡觀察腎組織超微結(jié)構(gòu) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時,取大約1 mm3體積的腎臟腎皮質(zhì)組織,在2.5%戊二醛溶液、2%四氧化鋨溶液中依次固定,然后在乙醇和丙酮中梯度脫水,最后進(jìn)行環(huán)氧樹脂包埋、切片．超薄切片經(jīng)過檸檬酸鉛和雙氧鈾染色后置于透射電鏡下觀察．

1.3.4 IL-1β和IL-6、TNF-α、CRP的含量測定 使用IL-1β、IL-6、TNF-α、CRP ELISA試劑盒檢測血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、CRP含量,實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行,最后計(jì)算血清樣本中各蛋白含量．

1.3.5 腎組織SOD活性和MDA含量的測定 腎皮質(zhì)組織置于冰浴中的PBS緩沖液中進(jìn)行勻漿,隨后在12 000×g的離心力下離心10 min并吸取上清液以備后續(xù)檢測．使用SOD和MDA檢測試劑盒進(jìn)行檢測,實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行,最后計(jì)算腎組織樣本中SOD的活性和MDA的含量．

1.4 藥物聯(lián)合作用評價

丹酚酸A與低劑量潑尼松的聯(lián)合作用分析采用Webb分?jǐn)?shù)乘積法:

q=(fa)1,2/{1-[1-(fa)1][1-(fa)2]}．

其中,(fa)1,2為丹酚酸A和低劑量潑尼松聯(lián)用時的效應(yīng),(fa)1和(fa)2分別為兩藥單用時的效應(yīng),其劑量分別為聯(lián)用中的劑量．q=1為相加作用,q> 1為協(xié)同作用,q<1為拮抗作用．

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 丹酚酸A與低劑量潑尼松聯(lián)合對大鼠24 h尿蛋白含量和血生化指標(biāo)的影響

為了評估丹酚酸A與低劑量潑尼松聯(lián)合對MCD的主要癥狀即蛋白尿、低白蛋白血癥、高脂血癥的影響,收集了大鼠的尿液和血液樣本進(jìn)行各項(xiàng)檢測．阿霉素尾靜脈注射造模后,與空白對照組相比,模型組大鼠24 h尿蛋白含量以時間依賴的方式持續(xù)上升,在第28天產(chǎn)生大量的尿蛋白,聯(lián)合丹酚酸A與低劑量潑尼松可以顯著降低第3周和第4周的尿蛋白和升高血清總蛋白含量,比丹酚酸A與低劑量潑尼松單用效果更加顯著,Webb分?jǐn)?shù)乘積q值分別為1.16(第3周)和1.22(第4周),顯示兩藥對尿蛋白的緩解有協(xié)同作用(表1)．

此外,與空白組大鼠相比,模型組大鼠的血清白蛋白明顯降低,而甘油三酯水平和總膽固醇水平明顯升高．聯(lián)合治療顯著升高大鼠血清白蛋白水平,降低甘油三酯和總膽固醇含量,效果優(yōu)于丹酚酸A和低劑量潑尼松單用(表2)．這些數(shù)據(jù)表明丹酚酸A和低劑量潑尼松聯(lián)合治療對MCD的主要癥狀有著顯著的治療效果．

表1 丹酚酸A與低劑量潑尼松聯(lián)合對不同時間點(diǎn)24 h尿蛋白含量的影響

注:與空白對照組相比,##P< 0.01;與模型組相比,*P< 0.05,**P< 0.01；括號中為聯(lián)合用藥的q值.

表2 丹酚酸A與低劑量潑尼松聯(lián)合對血生化指標(biāo)的影響

注:與空白對照組相比,##P<0.01;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01.

2.2 丹酚酸A與低劑量潑尼松聯(lián)合對大鼠腎功能的影響

為了評估丹酚酸A與低劑量潑尼松聯(lián)用對MCD大鼠腎功能的影響,檢測了血清SCr和BUN含量．與空白對照組大鼠相比,模型組大鼠血清SCr和BUN的含量明顯升高;與模型組相比,丹酚酸A與低劑量潑尼松聯(lián)合治療明顯降低了血清SCr和BUN的水平(表2)．這表明丹酚酸A與低劑量潑尼松聯(lián)合具有一定的保護(hù)腎功能的作用．

2.3 丹酚酸A與低劑量潑尼松聯(lián)合對腎組織超微結(jié)構(gòu)的影響

為探究丹酚酸A與低劑量潑尼松聯(lián)合對大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)的影響,利用透射電鏡觀察腎皮質(zhì)組織超薄切片．如圖2A所示,空白對照組大鼠腎足細(xì)胞足突清晰可見,無腫脹和萎縮,與空白對照組相比,模型組大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)的病理變化主要表現(xiàn)為足細(xì)胞足突的廣泛融合、裂孔間隙消失(圖2B中黑色三角處為典型足細(xì)胞融合區(qū)域),然而,丹酚酸A與低劑量潑尼松聯(lián)合治療能夠顯著地減少足突的融合范圍(圖2F),表明聯(lián)合治療能夠減輕阿霉素誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷．

圖2 丹酚酸A與低劑量潑尼松聯(lián)合對腎組織超微結(jié)構(gòu)的影響(標(biāo)尺=0.5 μm)

2.4 丹酚酸A與低劑量潑尼松聯(lián)合對血清IL-1β、IL-6、TNF-α、CRP含量的影響

為了探究聯(lián)合治療對于MCD大鼠炎癥的影響,檢測了血清中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、CRP的含量．與空白對照組相比,模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、CRP含量明顯升高,提示有炎癥的存在,聯(lián)合治療能夠顯著降低MCD大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、CRP水平,效果優(yōu)于丹酚酸A或低劑量潑尼松單用,表明聯(lián)合治療有更好的抗炎作用(表3)．

表3 丹酚酸A與低劑量潑尼松聯(lián)合對血清IL-1β、IL-6、TNF-α、CRP含量的影響

注:與空白對照組相比,##P< 0.01;與模型組相比,*P< 0.05,**P<0.01.

2.5 丹酚酸A與低劑量潑尼松聯(lián)合對腎組織MDA含量和SOD活性的影響

為研究聯(lián)合治療對腎組織氧化應(yīng)激的影響,檢測了腎組織MDA含量和SOD活性．與空白對照組相比,模型組大鼠腎組織SOD的活性明顯降低,而MDA的含量明顯升高;給予丹酚酸A與低劑量潑尼松聯(lián)合治療后,腎組織SOD的活性明顯升高,MDA的水平顯著降低,效果優(yōu)于兩藥單用,表明聯(lián)合治療擁有有效的抗氧化效果(表4)．

組別MDA含量/(nmol·mg-1)SOD活性/(U·mg-1) 空白對照0.63±0.24189.67±14.68 模型1.75±0.28##90.74±24.08## 高劑量潑尼松0.94±0.14**123.65±21.59* 低劑量潑尼松1.59±0.2198.68±15.33 丹酚酸A0.80±0.17**149.24±17.92** 丹酚酸A+低劑量潑尼松0.73±0.23**152.24±13.27**

注:與空白對照組相比,##P< 0.01;與模型組相比,*P< 0.05,**P<0.01.

3 討 論

阿霉素誘導(dǎo)的大鼠腎病模型,是最為經(jīng)典的微小病變型腎病動物模型之一[18-19]．在本研究中,采用7.5 mg/kg的阿霉素通過尾靜脈注射進(jìn)行造模,在造模1周后大鼠24 h尿蛋白以時間依賴的方式持續(xù)穩(wěn)定增加,到第4周時,相對正常組,模型組大鼠24 h尿蛋白、血清甘油三酯、總膽固醇含量顯著升高,血清總蛋白、白蛋白含量顯著降低,同時腎功能受到損傷,表現(xiàn)為大鼠血清BUN和SCr水平顯著升高(2個反映腎功能的重要指標(biāo)),進(jìn)一步在電鏡下發(fā)現(xiàn)腎足細(xì)胞足突的廣泛融合．這些結(jié)果都符合阿霉素腎病模型的特點(diǎn),也與臨床MCD的主要病理表現(xiàn)相符合[1],說明在本次實(shí)驗(yàn)中所使用的MCD大鼠模型符合實(shí)驗(yàn)要求,可以進(jìn)行后續(xù)的藥物干預(yù)研究．

本研究數(shù)據(jù)表明,丹酚酸A或低劑量潑尼松單用雖然在一定程度上可以緩解MCD大鼠的腎臟損傷,但是聯(lián)合給藥對阿霉素帶來的腎臟損傷有著更好的治療效果．聯(lián)合治療可以有效減少蛋白尿,蛋白尿是促進(jìn)MCD發(fā)展中的重要因素,盡管MCD中蛋白尿產(chǎn)生的機(jī)制仍然需要探究,但是目前蛋白尿的產(chǎn)生主要?dú)w功于腎小球?yàn)V過屏障(由腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基底膜和腎小球足細(xì)胞構(gòu)成的屏障)的改變[20]．本研究觀察到，阿霉素誘導(dǎo)的大鼠腎小球基底膜和內(nèi)皮細(xì)胞基本正常,但腎足細(xì)胞足突呈現(xiàn)廣泛的融合,給予藥物后,這種病理改變被聯(lián)合治療顯著改善．

MCD的病理生理過程極為復(fù)雜,過度的炎癥反應(yīng)已經(jīng)被證明是MCD損傷的重要原因[7-8]．MCD發(fā)病時IL-1β、IL-6、CRP等炎癥介質(zhì)增加并加重腎臟損傷,并誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子如TNF-α的產(chǎn)生及釋放,進(jìn)一步加重炎癥的破壞作用[7-8]．在本研究中,與空白對照組相比,MCD大鼠血清中IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α含量明顯升高,提示MCD大鼠血清細(xì)胞因子分泌紊亂,處于炎癥狀態(tài)．與模型組相比,聯(lián)合治療能夠顯著降低大鼠血清中IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α水平,表明丹酚酸A與低劑量潑尼松聯(lián)合對于MCD大鼠的炎癥具有有效的改善作用．

此外,有大量的臨床及實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明氧化應(yīng)激是MCD的一個重要發(fā)病機(jī)制[9]．氧化應(yīng)激主要是由于ROS的過量產(chǎn)生或機(jī)體抗氧化防御能力下降所導(dǎo)致的[9]．MDA和SOD是氧化應(yīng)激及組織損傷的2個理想標(biāo)志物,其中SOD是機(jī)體內(nèi)一種普遍存在的抗氧化酶[21],而MDA是ROS破壞脂質(zhì)的產(chǎn)物[11]．在本研究中,與空白對照組相比,阿霉素誘導(dǎo)的MCD大鼠腎臟組織MDA含量明顯升高,SOD活性顯著下降,表明腎臟氧化應(yīng)激狀態(tài)的產(chǎn)生,給予丹酚酸A與低劑量潑尼松聯(lián)合治療后,可以明顯改善SOD活性并減少腎組織MDA水平,表明聯(lián)合治療對于MCD大鼠腎臟氧化應(yīng)激狀態(tài)具有有效的保護(hù)作用．

Webb分?jǐn)?shù)乘積法由Webb于1963年提出,被廣泛應(yīng)用于判斷藥物的聯(lián)合作用性質(zhì)[22]．本研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)符合Webb分?jǐn)?shù)乘積法的要求,故通過此法進(jìn)行判斷丹酚酸A和低劑量潑尼松的聯(lián)合作用．利用Webb分?jǐn)?shù)乘積法計(jì)算聯(lián)合作用對MCD大鼠主要指標(biāo)尿蛋白影響的q值并判定,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合給藥對于MCD大鼠的尿蛋白改善有協(xié)同作用,結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,其增效機(jī)制可能與聯(lián)合給藥的抗炎和抗氧化作用有關(guān)．

4 結(jié) 論

綜上所述,丹酚酸A與低劑量潑尼松聯(lián)合治療對微小病變型腎病大鼠尿蛋白的治療有協(xié)同作用,并呈現(xiàn)出顯著的保護(hù)作用,并優(yōu)于丹酚酸A或低劑量潑尼松單用,有著良好的應(yīng)用前景,也為丹酚酸A用于臨床MCD的治療藥物的開發(fā)和應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)．