王 爽 張 洋 任夢(mèng)軒 劉瑩瑩 魏志剛

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040)

毛果楊(Populustrichocarp)基因組測(cè)序的完成，開啟了樹木與環(huán)境互作響應(yīng)的系統(tǒng)生物學(xué)研究大門。毛果楊的19條染色體含有4億8千5百萬(wàn)個(gè)DNA堿基對(duì)，是擬南芥的4倍[1]。預(yù)測(cè)楊樹編碼基因有4萬(wàn)5千5百個(gè)，其中大部分基因已被克隆。毛果楊已經(jīng)發(fā)展為研究樹木生物學(xué)、比較基因組學(xué)和環(huán)境互作組學(xué)系統(tǒng)的模式物種[1～2]。

WUSCHEL-related homeobox(WOX)基因家族是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族。WOX基因家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域是含有60個(gè)氨基酸的同源異型域(homeobox domain，HD)，而這些氨基酸能形成“螺旋—環(huán)—螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋”結(jié)構(gòu)，并與特定的DNA序列結(jié)合，如：CAAT-box、TATA-box、CTCC片段和TATTGTAGAC片段[3]。WUSCHEL(WUS)也屬于WOX基因家族，具有HD結(jié)構(gòu)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析將擬南芥的WOX基因家族分為三大分支。第一大分支是現(xiàn)代進(jìn)化分支，包括WUS和AtWOX1-7；第二大分支是中間分支，包括AtWOX8、AtWOX9、AtWOX11和AtWOX12；第三大分支是遠(yuǎn)古分支，包括AtWOX10、AtWOX13和AtWOX14[3]。研究發(fā)現(xiàn)，AtWUS和AtWOX5基因分別在莖尖和根尖分生組織中表達(dá)，參與維持分生組織細(xì)胞功能[4～6]，且AtWUS和AtWOX5在根干細(xì)胞調(diào)節(jié)中的功能可以相互交替[5]。AtWOX4和AtWOX14冗余調(diào)控維管分生組織的分化，并對(duì)維管束和干細(xì)胞維持起到重要作用[7]。AtWOX6會(huì)干擾原基從分生組織分化，終止原基的分化[8～9]。AtWOX11和AtWOX12在根部形成層中誘導(dǎo)表達(dá)，促進(jìn)不定根的發(fā)生[10]。AtWOX13促進(jìn)果實(shí)發(fā)育過(guò)程中胚座的形成[11]。這些研究表明WOX基因家族與植物的初生和次生物質(zhì)代謝、胚胎發(fā)育及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程緊密相關(guān)。

已有文章對(duì)擬南芥、水稻和小桐子等WOX基因家族的表達(dá)模式、蛋白結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系進(jìn)行了研究[3,12～14]，而對(duì)毛果楊WOX基因家族的相關(guān)研究尚未有報(bào)道。本研究利用毛果楊最新的基因組數(shù)據(jù)(Populustrichocarpav3.0)，從全基因組范圍鑒定了毛果楊WOX基因家族并對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、親緣關(guān)系、染色體定位和莖部發(fā)育表達(dá)模式進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究WOX基因家族在毛果楊莖部發(fā)育中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

野生型毛果楊在林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))溫室中長(zhǎng)日照培養(yǎng)，室內(nèi)溫度25±2℃。生長(zhǎng)三個(gè)月后，分別取其初生階段(1～2莖節(jié))、過(guò)渡階段(3～4莖節(jié))和次生階段(5～8莖節(jié))的莖部液氮速凍，提取RNA樣品，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和qRT-PCR驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 石蠟切片及觀察

取三個(gè)月大的毛果楊莖部固定于FAA固定液中，通過(guò)包埋、切片和脫蠟，分別用甲苯胺藍(lán)、間苯三酚和Calcofuor White Sain染液對(duì)切片進(jìn)行染色，拍照觀察。

1.3 毛果楊WOX基因家族的分類和分析

從植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中分別獲得了15個(gè)擬南芥和18個(gè)楊樹WOX基因的氨基酸序列；利用北京大學(xué)轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)(PlantTFDB-Plant Transcription Factor Database@CBI,PKU)獲得楊樹WOX基因家族的分子量和等電點(diǎn)數(shù)據(jù)；利用Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)獲得染色體位置和各組織表達(dá)量數(shù)據(jù)。利用MEGA6.0軟件中的Neighbor joining的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用BioEdit軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，來(lái)確定這些搜索到的WOX基因家族是否具有完整的HD結(jié)構(gòu)域。MEME(http://meme.nbcr.net/meme/)在線軟件被用于分析毛果楊WOX蛋白的保守基序。

1.4 毛果楊WOX基因qRT-PCR分析

利用2-△△Ct分析方法對(duì)毛果楊表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)，相關(guān)定量引物見表1。

表1 qRT-PCR的引物

圖1 毛果楊早期發(fā)育莖節(jié)的解剖和組織化學(xué)染色 A.溫室中生長(zhǎng)3個(gè)月毛果楊取材示意圖；B、E和H.第2莖節(jié)橫切面圖；C、F和I.第4莖節(jié)橫切面圖；D、G和J.第8莖節(jié)橫切面圖；B、C和D.甲苯胺藍(lán)染色；E、F和G.間苯三酚染色；H、I和J.Calcofluor White Sain的染色Fig.1 Anatomical and histochemical analyses of the successive internodes of the P.trichocarpa early developing stem A. Three months old Populus trees grown in the greenhouse as plant material schematic for this study; B,E and H. The second internode cross section; C,F and J. The fourth internode cross section; D,G and I. The eighth internode cross section; B,C and D. Toluidine blue stains; E,F and G. Phloroglucinol stain; H,I and J. Calcofluor white-stained

基因號(hào)Gene ID基因名字Gene name基因的位置Genomic position長(zhǎng)度Length(aa)分子量MW(kDa)等電點(diǎn)plCDs長(zhǎng)度Length of CDS(bp)Potri.001G237900.1PtrWOX1.1Chr01:24918823..2492023024527.888.35738Potri.002G008800.1PtrWOX2.1Chr02:484202..48634521524.485.33648Potri.002G124100.1PtrWOX2.2Chr02:9309765..931132021324.429.15642Potri.004G051600.1PtrWOX4.1Chr04:4008260..401029739043.089.11173Potri.005G101800.1PtrWOX5.1Chr05:7788135..779095824827.995.51747Potri.005G114700.1PtrWOX5.2Chr05:8858336..885998026430.046.33795Potri.005G252800.1PtrWOX5.3Chr05:25454469..2545650721624.645.73651Potri.007G012100.1PtrWOX7.1Chr07:958955..96028726429.286.43795Potri.008G065400.1PtrWOX8.1Chr08:3963469..396410418121.018.99546Potri.009G029200.1PtrWOX9.1Chr09:3976470..397782324627.616.75741Potri.010G111400.1PtrWOX10.1Chr10:13009243..1301095031635.718.31951Potri.010G192100.1PtrWOX10.2Chr10:18688337..1868905017119.626.96516Potri.011G061400.1PtrWOX11.1Chr11:5466036..546841737741.617.751134Potri.012G047700.1PtrWOX12.1Chr12:4446344..444908838743.975.621164Potri.013G066900.1PtrWOX13.1Chr13:5239050..524069225528.095.69768Potri.014G025300.1PtrWOX14.1Chr14:2169818..217137921324.479.03642Potri.015G039100.1PtrWOX15.1Chr15:3566414..356921737442.336.611125Potri.019G040800.1PtrWOX19.1Chr19:4693429..469523822625.016.16681

2 結(jié)果分析

2.1 毛果楊早期莖部發(fā)育及組織化學(xué)染色

為了研究毛果楊莖部發(fā)育過(guò)程中的變化，通過(guò)形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)染色分析，將毛果楊莖部發(fā)育分為三個(gè)典型階段，即，初生階段(第1～2莖節(jié))、過(guò)渡階段(第3～4莖節(jié))和次生階段(第5～8莖節(jié))[15]。因此，分別選擇第2、4和8莖節(jié)代表三個(gè)不同的發(fā)育階段(圖1)。在第2莖節(jié)中，僅有初生生長(zhǎng)，通過(guò)甲苯胺藍(lán)染色、間苯三酚染色和Calcofluor White Sain染色發(fā)現(xiàn)，原始細(xì)胞形成的維管束僅有初生木質(zhì)部和初生韌皮部(圖1:B、E和H)；在第4莖節(jié)中，出現(xiàn)了少量的次生生長(zhǎng)(圖1:C)，初生和次生木質(zhì)部均被染成紅色(圖1:F)，初生和次生韌皮部為藍(lán)色(圖1:I)；在第8莖節(jié)中，次生生長(zhǎng)明顯增強(qiáng)(圖1:D、G和J)。

2.2 毛果楊WOX基因家族概況

利用已經(jīng)鑒定出的15個(gè)AtWOX基因，通過(guò)Plant TFDB基因數(shù)據(jù)庫(kù)查找到同源的18個(gè)PtrWOX基因?；赑trWOX基因在染色體上的位置分布，將18個(gè)PtrWOX基因分別命名為PtrWOX1.1-PtrWOX19.1。PtrWOX基因?qū)?yīng)的編碼序列長(zhǎng)度從516 bp(PtrWOX10.2)到1 173 bp(PtrWOX4.1)，蛋白質(zhì)分子量的大小從19.62～43.97 kDa(表2)。

2.3 擬南芥和毛果楊WOX基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用MEGA6.0軟件中的Neighbor joining法對(duì)擬南芥和毛果楊WOX基因家族進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖2)。根據(jù)AtWOX和PtrWOX基因家族的蛋白序列，分別將15個(gè)AtWOX和18個(gè)PtrWOX基因分為3個(gè)分支，即Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。在Ⅰ分支中，PtrWOX5.2、PtrWOX7.1和AtWUS1在同一個(gè)進(jìn)化分枝上，說(shuō)明同屬WUS基因亞家族；PtrWOX8.1和PtrWOX10.2在同一個(gè)小分支上，親緣關(guān)系較近；PtrWOX12.1和PtrWOX15.1同屬于一個(gè)小分支親緣關(guān)系比較近；PtrWOX1.1、PtrWOX9.1和AtWOX2親緣關(guān)系較近，推斷表達(dá)模式可能相近；PtrWOX2.2和PtrWOX14.1與AtWOX4親緣關(guān)系近，推斷可能和莖部發(fā)育有關(guān)；PtrWOX4.1、PtrWOX11.1、PtrWOX13.1和PtrWOX19.1同屬于Ⅱ分支，親緣關(guān)系較近；PtrWOX2.1、PtrWOX5.1和PtrWOX5.3同屬于Ⅲ分支，親緣關(guān)系同樣較近。

圖2 擬南芥與毛果楊WOX基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree of WOX gene families in Arabidopsis and P.trichocarpa

2.4 毛果楊WOX家族基因保守基序分析

通過(guò)MEME和BioEdit軟件分別對(duì)18個(gè)PtrWOX基因的保守基序和蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析(圖3～4)。如圖3所示，多個(gè)獨(dú)立的保守基序被鑒定，命名為基序1-10。其中基序1和2為HD結(jié)構(gòu)，存在于所有的PtrWOX基因中；基序4為WUS-box基序(TLXLTP)，存在于組Ⅰ所有PtrWOX基因中；組Ⅱ中都存在基序10；組Ⅲ都存在基序9。而PtrWOX基因家族的蛋白序列均包含一個(gè)高度保守的“螺旋—環(huán)—螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋”結(jié)構(gòu)域(圖4A),僅有7個(gè)PtrWOX基因家族的蛋白序列含有WUS-box基序(圖4B)。結(jié)果表明，鑒定出的18個(gè)PtrWOX基因均為WOX基因家族成員，進(jìn)一步支持了系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果，且同一分支中的基因可能具有相似的功能。

圖3 毛果楊WOX基因蛋白保守基序分析Fig.3 Analysis of the conserved motif of WOX genes proteins in P.trichocarpa

圖4 毛果楊WOX基因蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域分析 A.WOX蛋白螺旋—環(huán)—螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋結(jié)構(gòu)域分析；B.WOX蛋白WUS-box基序分析Fig.4 Conserved domain analysis of WOX genes protein sequences in P.trichocarpa A.The analysis of WOX proteins helix-loop-helix-turn-helix-helix domain; B.WOX protein WUS-box motif analysis

2.5 毛果楊WOX基因家族的基因結(jié)構(gòu)分析

利用PtrWOX基因家族的CDs序列分析基因結(jié)構(gòu)(圖5)。結(jié)果表明，外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)在該基因家族中存在差異，內(nèi)含子數(shù)量從1到4不等，親緣關(guān)系較近的基因中含有大致相同數(shù)量的內(nèi)含子。例如，在Ⅲ分支中，除了PtrWOX13.1含有2個(gè)內(nèi)含子外，其他成員均包含4個(gè)內(nèi)含子；Ⅱ分支中的PtrWOX2.1和PtrWOX5.1都有一個(gè)內(nèi)含子；PtrWOX10.1和PtrWOX15.1屬同一分支，都有四個(gè)內(nèi)含子；然而PtrWOX12.1只有一個(gè)內(nèi)含子，但同源的PtrWOX15.1中卻有3個(gè)內(nèi)含子。結(jié)果進(jìn)一步支持了系統(tǒng)進(jìn)化樹中PtrWOX基因分類，同一分支中的基因可能具有相似的功能。

2.6 毛果楊WOX基因家族基因染色體定位分析

基于phytozome網(wǎng)站數(shù)據(jù)，對(duì)18個(gè)PtrWOX基因進(jìn)行了染色體定位分析。結(jié)果表明，18個(gè)PtrWOX基因不均勻的分布在各條染色體上。其中1、4、7、8、9、11、12、13、14、15和19號(hào)染色體上均分布1個(gè)PtrWOX基因；2和10號(hào)染色體上均分布2個(gè)PtrWOX基因；5號(hào)染色體上分布3個(gè)PtrWOX基因；3、6、16、17和18號(hào)染色體上沒有分布(圖6)。18個(gè)PtrWOX基因形成了8個(gè)旁系同源基因?qū)?，且每?duì)同源基因都不在同一染色體上。說(shuō)明家族在進(jìn)化過(guò)程中可能出現(xiàn)過(guò)基因復(fù)制事件。已有研究表明，毛果楊GT基因家族中鑒定出15個(gè)旁系同源基因?qū)?，其?4個(gè)發(fā)生了基因重復(fù)事件[16]。

圖5 毛果楊WOX家族進(jìn)化樹及基因結(jié)構(gòu)Fig.5 The phylogenetic relationships and gene structures of WOX gene family from P.trichocarpa

圖6 PtrWOX基因在毛果楊染色體上的定位Fig.6 Location of PtrWOX genes in P.trichocarpa on chromosome

2.7 毛果楊WOX基因家族組織表達(dá)特異性分析

為了研究PtrWOX基因家族在毛果楊莖部生長(zhǎng)發(fā)育的作用，分別利用MeV軟件對(duì)phytozome網(wǎng)站中18個(gè)PtrWOX基因在各個(gè)組織中的表達(dá)量和毛果楊莖部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)繪制色溫圖(圖7)并進(jìn)行分析。結(jié)果表明，18個(gè)PtrWOX基因在楊樹各組織表達(dá)情況并不一致(圖7A)。其中PtrWOX1.1、PtrWOX8.1、PtrWOX9.1、PtrWOX19.1基因在莖部沒有表達(dá)量(圖7B)；PtrWOX2.1、PtrWOX2.2、PtrWOX5.1和PtrWOX14.1在莖部的表達(dá)量比較高。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PtrWOX基因家族在毛果楊莖部不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，選取部分PtrWOX基因家族成員進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，qRT-PCR結(jié)果與表達(dá)譜數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)基本一致，其中PtrWOX2.1、PtrWOX2.2和PtrWOX5.1在次生莖部表達(dá)量較高，PtrWOX14.1在過(guò)渡莖部表達(dá)量最高。該結(jié)果表明，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的PtrWOX基因家族表達(dá)數(shù)據(jù)可靠。

圖7 毛果楊WOX基因在莖部發(fā)育表達(dá)模式分析 A.phytozome網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果；B.轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果Fig.7 The expression pattern analysis of WOX genes in stem development in P.trichocarpa A.phytozome website predicted the results; B.Transcriptome data results

圖8 qRT-PCR分析Fig.8 Analysis of the qRT-PCR

3 討論

毛果楊是木本模式植物，在2006年毛果楊全基因組測(cè)序完成，使得利用生物信息學(xué)方法分析毛果楊各基因家族成為可能。迄今為止，毛果楊中LBD、HMA、FLA、HSF、CLE等多個(gè)基因家族已經(jīng)被分析鑒定[17～22]。而毛果楊WOX基因家族在莖部發(fā)育的研究尚未有報(bào)道。WOX基因家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在擬南芥的根和花序莖發(fā)育中起著重要作用。

本研究從毛果楊基因組中鑒定出18個(gè)WOX基因家族成員(表2)，其家族成員數(shù)目與擬南芥和水稻相近，均具有高度保守的HD結(jié)構(gòu)域(圖4A)，少數(shù)含有特異性的WUS-box結(jié)構(gòu)域(圖4B)。說(shuō)明WOX基因家族在進(jìn)化過(guò)程中具有較高的保守性。家族進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，共存在8個(gè)旁系同源基因?qū)?，且均分布在不同染色體上(圖5)，說(shuō)明該家族在進(jìn)化過(guò)程中可能出現(xiàn)過(guò)基因復(fù)制事件；親緣關(guān)系較近的基因中含有大致相同數(shù)量的內(nèi)含子，表明進(jìn)化關(guān)系相近的基因具有相似的結(jié)構(gòu)。染色體定位分析說(shuō)明，18個(gè)PtrWOX基因隨機(jī)分布在毛果楊15條染色體上(圖6)。擬南芥和毛果楊WOX基因的進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，具有相似功能的WOX基因聚集在同一分枝，可為預(yù)測(cè)毛果楊WOX家族中基因的功能提供重要參考依據(jù)(圖1)。AtWOX2、AtWOX3和AtWOX4對(duì)維管束形成層和原始形成層有調(diào)控作用[6～7]，PtrWOX1.1、PtrWOX2.2、PtrWOX9.1、PtrWOX10.1和PtrWOX14.1均是它們的同源基因，但研究發(fā)現(xiàn)PtrWOX2.2和PtrWOX14.1在莖部表達(dá)量較高(圖7)，其余基因表達(dá)量低或不表達(dá)，說(shuō)明PtrWOX2.2和PtrWOX14.1可能在毛果楊莖部維管束形成層中發(fā)揮功能。AtWOX13基因被證實(shí)與側(cè)根的形成和花的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)[11]，PtrWOX5.3是與楊樹木質(zhì)部形成有關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子[23]，PtrWOX2.1和PtrWOX5.1是它們的同源基因，且在毛果楊莖部表達(dá)量較高(圖8)，可能與莖部發(fā)育有關(guān)。PtrWOX5.2和PtrWOX10.2分別是AtWUS和AtWOX5的同源基因，AtWUS和AtWOX5參與維持頂端分生組織細(xì)胞功能[4～6]，PtrWOX5.2和PtrWOX10.2在莖部發(fā)育各個(gè)階段均有表達(dá)，可能參與維持莖部分生組織細(xì)胞功能。綜上所述，PtrWOX基因家族中PtrWOX2.1、PtrWOX2.2、PtrWOX5.1、PtrWOX5.2、PtrWOX5.3、PtrWOX10.2和PtrWOX14.1，可能參與毛果楊的莖部發(fā)育。

為了全面了解毛果楊WOX基因家族特性，本研究對(duì)鑒定出的18個(gè)PtrWOX基因進(jìn)行了染色體定位、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化關(guān)系以及表達(dá)模式分析，為今后進(jìn)一步研究該家族基因奠定基礎(chǔ)。