楊鯨蓉　吳健　葉仕新　連鐸煌　曾志勇

[摘要] 目的 探討血清microRNA（miRNA）與食管鱗癌新輔助化放療（NCRT）效果的關(guān)系及其預(yù)測(cè)價(jià)值。 方法 選取南京軍區(qū)福州總醫(yī)院2015年1月～2016年12月收治的接受術(shù)前NCRT的cT3-4N0食管鱗癌患者30例，NCRT前采集患者外周血，根據(jù)術(shù)后病理結(jié)果，分為敏感組和抵抗組，每組各15例;采用miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)篩選出食管鱗癌NCRT敏感組和抵抗組差異表達(dá)的血清miRNA，然后，擴(kuò)大樣本量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證初篩的血清miRNA;分析篩選并驗(yàn)證的miRNA和NCRT效果的關(guān)系;受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)價(jià)miRNA預(yù)測(cè)NCRT效果的價(jià)值。 結(jié)果 兩組患者血清共篩查出16個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中miRNA-23，miRNA-211，miRNA-323經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。三者與食管鱗癌NCRT近期效果的曲線下面積分別為0.764、0.880和0.707。 結(jié)論 miRNA-23、miRNA-211和miRNA-323對(duì)食管鱗癌NCRT近期效果的評(píng)估可能具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 食管鱗癌;新輔助化放療;微小RNA;臨床應(yīng)用

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.1 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2019）05（b）-0096-05

[Abstract] Objective To investigate the relationship between serum microRNA（miRNA） and neoadjuvant radiotherapy （NCRT） for esophageal squamous cell carcinoma and its predictive value. Methods From January 2015 to December 2016， 30 patients with preoperative NCRT cT3-4N0 esophageal squamous cell carcinoma admitted to Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command were selected. Peripheral blood of the patients were collected before NCRT. According to the postoperative pathological results， the patients were divided into the sensitive group and the resistance group， with 15 cases in each group. The differentially expressed serum mirnas in the NCRT sensitive group and the resistance group were detected by miRNA expression profile microarray. Then， the sample size was expanded for real-time fluorescence quantitative PCR to verify the initially screened serum mirnas. The relationship between the efficacy of miRNA and NCRT was analyzed and verified. Subject operating characteristic （ROC） curves were used to evaluate the value of miRNA in predicting the efficacy of NCRT. Results A total of 16 differentially expressed mirnas were detected in the serum of the two groups， among which miRNA-23， miRNA-211 and miRNA-323 were verified by qRT-PCR， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. The area under the curve of the short-term efficacy of the three factors and esophageal squamous cell carcinoma NCRT was 0.764， 0.880 and 0.707， respectively. Conclusion The evaluation of miRNA-23， miRNA-211 and miRNA-323 in the short-term efficacy of esophageal squamous cell carcinoma NCRT may have certain predictive value.

[Key words] Esophageal squamous cell carcinoma; Neoadjuvant chemoradiation; microRNA; Clinical application

我國(guó)食管鱗癌最為常見(jiàn)。對(duì)可切除的食管癌患者而言，外科治療是食管癌治療的首選方法。但食管癌患者單純手術(shù)生存率低，效果不盡人意。為提高食管癌治療效果，多項(xiàng)研究[1-2]表明，術(shù)前新輔助化放療（neoadjuvant chemoradiation，NCRT）可顯著提高局部進(jìn)展期食管癌患者的5年生存率，改善預(yù)后。術(shù)前NCRT可提高食管癌患者生存率，但主要獲益者是NCRT敏感者。而NCRT抵抗的食管癌患者失去最合適的手術(shù)切除機(jī)會(huì)，預(yù)后甚至比單純手術(shù)更差。目前研究[3-8]表明，miRNA的差異表達(dá)與腫瘤化療/放療敏感性有著密切聯(lián)系。本研究通過(guò)miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)食管鱗癌NCRT敏感和抵抗患者差異表達(dá)的血清miRNA;然后，擴(kuò)大樣本量進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，旨在尋找潛在的預(yù)測(cè)食管癌NCRT敏感性的生物學(xué)標(biāo)志物。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取福建省福州總醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）2015年1月～2016年12月收治的30例接受術(shù)前NCRT的食管癌患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：內(nèi)鏡活檢組織病理學(xué)提示食管鱗狀細(xì)胞癌;局部進(jìn)展期食管癌，T3～4或淋巴結(jié)陽(yáng)性的可切除胸段食管癌患者;無(wú)明顯化療、放療及手術(shù)禁忌證;NCRT后4～6周行食管癌切除術(shù);能簽署治療知情同意書(shū)，對(duì)治療和隨訪有良好的依從性。排除標(biāo)準(zhǔn)：不滿足任一納入標(biāo)準(zhǔn)者;其他部位惡性腫瘤史;嚴(yán)重心血管疾病，嚴(yán)重肝腎功能障礙及其他不能耐受化放療的合并癥者;出現(xiàn)嚴(yán)重治療相關(guān)并發(fā)癥，不能繼續(xù)治療或常規(guī)隨訪;患者中途放棄治療;失訪。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，且入選者均已簽署知情同意書(shū)。本入研究中，NCRT敏感組15例，NCRT抵抗組15例。兩組患者年齡、性別、部位、腫瘤臨床分期、組織學(xué)分級(jí)等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。

1.2 治療方法

采用常規(guī)分割放療200 cGy/d，每周5 d，共20次，總量40 Gy。靶區(qū)包括腫瘤靶區(qū)和臨床靶區(qū)，即原發(fā)食管腫瘤病灶、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和亞臨床病灶（食管腫瘤上下3 cm正常食管及食管旁淋巴引流區(qū)）。放療同期采用DP方案：多西他賽（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，10 mg/支，批號(hào)：16060116）75 mg/m2，靜脈滴注（2～3 h），第1天;順鉑（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，30 mg/支，批號(hào)：160402）75 mg/m2，靜脈滴注（2 h），第1～3天。21 d為1個(gè)周期，共2次。然后，間隔4～8周進(jìn)行食管癌根治術(shù)。

1.3 NCRT方案效果的評(píng)估

根據(jù)NCRT后4～6周行微創(chuàng)食管癌切除術(shù)后病理結(jié)果評(píng)估NCRT效果[9-10]。NCRT后病理反應(yīng)分級(jí)是通過(guò)殘留腫瘤細(xì)胞與周?chē)w維組織的比例來(lái)劃分的。腫瘤退縮1級(jí)（TRG1）為無(wú)腫瘤細(xì)胞殘留;腫瘤退縮2級(jí)（RRG2）為殘留腫瘤細(xì)胞占1%～10%;腫瘤退縮3級(jí)（TRG3）為殘留腫瘤細(xì)胞占11%～50%;腫瘤細(xì)胞退縮4級(jí)（TRG4）為殘留腫瘤細(xì)胞占50%以上;腫瘤退縮5級(jí)（TRG5）為無(wú)腫瘤退縮改變。目前研究[11-12]表明病理完全緩解和TRG2（TRG1～2）患者可從新輔助治療中獲益。因此本研究將TRG1～2納入治療敏感組，TRG3～5為抵抗組。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 血清標(biāo)本收集 ?符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者在接受NCRT前，征得患者同意后由臨床醫(yī)師收集食管癌術(shù)前NCRT敏感組和抵抗組患者的外周血5 mL，EDTA抗凝，低溫低速離心機(jī)1000 r/min離心10 min，取勻漿上清，于無(wú)RNA酶EP管中-70℃低溫保存。

1.4.2 miRNA芯片初篩 ?3例食管癌NCRT敏感者血清和3例NCRT抵抗者血清標(biāo)本送至上海康成生物工程有限公司進(jìn)行miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)。首先應(yīng)用Trizol法提取RNA，并用RNasey Mini kit（QIAGEN）純化。使用NanoDrop ND-1000測(cè)量純化后的RNA濃度，電泳檢測(cè)RNA完整性。RNA標(biāo)記和雜交根據(jù)Exiqon提供的方法進(jìn)行。抽提的RNA通過(guò)質(zhì)檢后，使用miRCURYTM Array Power Labeling kit（Cat #208032-A，Exiqon）對(duì)miRNA進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記完成后，將樣品與miRCURYTM LNA Array（v.19.0）（Exiqon）芯片雜交，雜交完成后，使用Wash buffer kit（Exiqon）清洗芯片。最后使用Axon GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片。結(jié)果經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析，根據(jù)差異倍數(shù)≥1.5且P < 0.05篩選與NCRT敏感患者血清相比在NCRT抵抗患者血清中差異表達(dá)的miRNA。

1.4.3 Real-time PCR檢測(cè)miRNA的表達(dá) ?提取剩余患者血清RNA，按Qiagen公司的miRNaesy Mini Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。在miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)種獲取目標(biāo)miRNA的引物，利用莖環(huán)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以合成的cDNA作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增（同時(shí)測(cè)定每個(gè)樣品中hsa-miRNA-93-5p含量作為內(nèi)參以校正上樣誤差）。分析實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量樣品中的目的miRNA。以hsa-miRNA-93-5p作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，符合正態(tài)分布時(shí)，兩組數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn);兩組計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn);等級(jí)資料采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn);應(yīng)用受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)價(jià)目標(biāo)miRNA的表達(dá)在食管鱗癌NCRT效果預(yù)測(cè)中的臨床價(jià)值。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌術(shù)前NCRT敏感組和抵抗組患者血清miRNA表達(dá)譜比較

表達(dá)譜芯片雜交后，結(jié)果經(jīng)過(guò)分析，根據(jù)改變倍數(shù)≥1.5且P < 0.05篩選出食管鱗癌術(shù)前NCRT敏感組和抵抗組患者中有差異表達(dá)的miRNA。共檢測(cè)出112個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中18個(gè)表達(dá)上調(diào)，94個(gè)表達(dá)下調(diào)。其中共有16種miRNA在食管癌術(shù)前NCRT敏感組和抵抗組血清標(biāo)本中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表2。其中上調(diào)表達(dá)的有3種，下調(diào)表達(dá)的miRNA有13種。差異表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miRNA的熱圖。見(jiàn)圖1（封四）。

2.2 qRT-PCR對(duì)miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證

用qRT-PCR對(duì)16種miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。其中miRNA-211-5p、miRNA-323b-3p和miRNA-23c 三個(gè)miRNA在食管癌術(shù)前NCRT敏感組患者中的表達(dá)相對(duì)于抵抗組的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 ROC曲線分析

以手術(shù)切除后組織的病理報(bào)告為“金標(biāo)準(zhǔn)”，評(píng)估食管鱗癌患者行術(shù)前NCRT是否敏感。繪制miRNA-23c、miRNA-211-5p和miRNA-323b-3p在預(yù)測(cè)食管癌術(shù)前NCRT敏感性的ROC曲線。見(jiàn)表4、圖2。

3 討論

術(shù)前NCRT可提高食管癌患者生存率，但主要獲益者是NCRT敏感者，而NCRT抵抗的食管癌患者預(yù)后甚至比單純手術(shù)更差。因此，如果治療前能預(yù)測(cè)食管癌NCRT效果，篩選出NCRT敏感人群，則可對(duì)食管癌患者進(jìn)行分層;使對(duì)NCRT敏感者從NCRT中獲得最大利益;NCRT抵抗者則可建議其他治療模式，規(guī)避NCRT毒副作用的危害;從而提高食管癌的總體效果，改善預(yù)后。目前預(yù)測(cè)食管NCRT效果及預(yù)后相關(guān)因素有：食管癌的病理分型，分化程度等臨床因素，另外，從分子層面進(jìn)行食管癌NCRT預(yù)后因素的探索，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，如抑癌基因、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子、DNA損傷修復(fù)基因、耐藥蛋白、血管生成因子等[13-14]。但至今，未找到高度敏感而又經(jīng)濟(jì)有效的可預(yù)測(cè)食管癌NCRT效果的生物學(xué)標(biāo)志物。microRNA（miRNA）是一類(lèi)具有內(nèi)源性、功能性的非編碼RNA。目前有研究[3-8]表明，miRNA的差異表達(dá)與腫瘤化療/放療敏感性有著密切聯(lián)系。本研究通過(guò)miRNA表達(dá)譜的篩查分析食管鱗癌NCRT敏感組和抵抗組血清miRNA表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），首次闡明血清miRNA表達(dá)譜與食管鱗癌NCRT效果的關(guān)系，篩選出可預(yù)測(cè)食管鱗癌NCRT效果的血清miRNA。

miRNA預(yù)測(cè)食管癌NCRT效果的既往研究少有報(bào)道。Skinner等[3]篩選出miRNA：miRNA-505，miRNA-99b、miRNA-451、miRNA-145與食管癌NCRT相關(guān)，并通過(guò)建立miRNA表達(dá)譜評(píng)分并結(jié)合T分期、腫瘤分級(jí)來(lái)預(yù)測(cè)食管腺癌NCRT的有效性。Bibby等[4]研究表明miRNA-330-5p可作為食管腺癌的NCRT敏感性的預(yù)測(cè)生物學(xué)標(biāo)志物，并可作為NCRT敏感性的一種新的治療靶點(diǎn)。Odenthal等[5]研究表明血清miRNA-222和miRNA-302c可作為胃食管連接部腺瘤的綜合治療效果的預(yù)測(cè)。Ko等[6]研究了25例Ⅲ期食管癌（鱗癌、腺癌）NCRT前后miRNA的差異表達(dá)，在病理完全緩解組和非病理完全緩解組，有5種miRNA（HS-240、hsa-miRNA-296、hsa-miRNA-31、hsa-miRNA-31和HS-217）的表達(dá)差異超過(guò)2倍，但并未進(jìn)一步篩選并證明可作為預(yù)測(cè)食管癌NCRT的miRNA。本研究中共篩查出16種miRNA在食管癌術(shù)前NCRT敏感組和抵抗組血清標(biāo)本中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），其中上調(diào)表達(dá)的有3種，下調(diào)表達(dá)的miRNA有13種。通過(guò)qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證。其中miRNA-211-5p、miRNA-323b-3p和miRNA-23c 三個(gè)miRNA在食管癌術(shù)前NCRT敏感組患者中的表達(dá)相對(duì)于抵抗組的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。這與既往研究[3-6]結(jié)果并不一致，可能的原因是既往研究對(duì)象均包含食管腺癌患者，而本研究?jī)H選取的是我國(guó)常見(jiàn)的食管鱗癌患者。另外患者入組條件，NCRT效果分組標(biāo)準(zhǔn)也有所不同，當(dāng)然本研究樣本量小也是一個(gè)因素，仍需要大樣本量的研究。

本研究中miRNA-211在食管鱗癌NCRT敏感組較抵抗組差異表達(dá)下調(diào)，定量分析其差異倍數(shù)為1.5倍。而關(guān)于miRNA-211與NCRT近期效果的分析提示敏感組的miRNA-211低表達(dá)率為86.7%，高于抵抗組的26.7%，提示miRNA-211下調(diào)表達(dá)量越低，NCRT越高。本研究進(jìn)一步使用ROC曲線評(píng)價(jià)miRNA-211對(duì)于食管鱗癌NCRT敏感性的預(yù)測(cè)價(jià)值，曲線下面積為0.880，具有較好的診斷效能。Shafiee等[7]研究表明miRNA-211的過(guò)表達(dá)可引起食管鱗癌細(xì)胞SOX2OT和SOX2基因的下調(diào)，而SOX2OT和SOX2基因在腫瘤發(fā)生和多能性中有重要的作用。Zhang等[8]研究表明上調(diào)miRNA-211-5p可顯著抑制細(xì)胞和恢復(fù)化療敏感性。Asuthkar等[15]研究表明miRNA-211上調(diào)或者下調(diào)MMP-9，可增強(qiáng)化放療治療效果。

既往報(bào)道m(xù)iRNA-323與胰腺癌、前列腺癌和甲狀腺癌相關(guān)[16-17]，但在食管癌中鮮有報(bào)道。miRNA-323的缺失使PC-3前列腺癌細(xì)胞在G0/G1期停滯，并引起顯著的凋亡。多西紫杉醇耐藥的前列腺癌細(xì)胞miRNA-323表達(dá)水平較親本細(xì)胞高5.6倍。miRNA-323的過(guò)表達(dá)使前列腺癌細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的抑制濃度（IC50）值增高了50%[16]。本研究探討了miRNA-323與食管鱗癌的關(guān)系。在食管鱗癌NCRT敏感組患者血清miRNA-323呈下調(diào)趨勢(shì)，進(jìn)一步定量?jī)山M之間的差異倍數(shù)為1.22倍。ROC曲線下面積為0.707，提示miRNA-323在預(yù)測(cè)食管鱗癌NCRT效果方面有一定的價(jià)值。

miRNA-23參與包括神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程，常起致癌基因的作用。Shang等[18]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-23a對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞氟尿嘧啶的敏感性具有明顯的抑制作用;抑制miRNA-23的表達(dá)可增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，引起細(xì)胞周期阻滯G0/G1期，增加細(xì)胞凋亡率[19]。另外，輻射誘導(dǎo)的胸腺淋巴瘤組織樣本中miRNA-23 a和miRNA-23 b上調(diào)，而miRNA-23a/b模擬物則淋巴瘤細(xì)胞死亡和凋亡。這可能與miRNA-23a/b的過(guò)表達(dá)降低了Fas蛋白的表達(dá)水平有關(guān)[20]。本研究中miRNA-23在食管鱗癌NCRT敏感組中呈下調(diào)表達(dá)，定量分析其差異倍數(shù)為1.31倍。本研究進(jìn)一步使用ROC曲線評(píng)價(jià)miRNA-23在食管鱗癌NCRT預(yù)測(cè)效果價(jià)值，ROC曲線下面積為0.764。提示miRNA-23對(duì)NCRT敏感性有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，本研究通過(guò)miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)食管鱗癌NCRT敏感組和抵抗組差異表達(dá)的血清miRNA;共篩查出16種miRNA在食管癌術(shù)前NCRT敏感組和抵抗組血清標(biāo)本中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），其中上調(diào)表達(dá)的有3種，下調(diào)表達(dá)的miRNA有13種。通過(guò)qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證。其中miRNA-211-5p、miRNA-323b-3p和miRNA-23c這3個(gè)miRNA在食管癌術(shù)前NCRT敏感組患者中的表達(dá)相對(duì)于抵抗組的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)合臨床資料，通過(guò)準(zhǔn)確性檢驗(yàn)分析（ROC曲線）判斷上述3種血清miRNA在預(yù)測(cè)食管鱗癌NCRT效果的價(jià)值。后續(xù)仍需要通過(guò)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證結(jié)果，并探討其參與化放療敏感性調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。

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（收稿日期：2018-09-14 ?本文編輯：封 ? 華）