曲根，劉建宇，郭志鵬，王苗利，管永卓，張靖雪，郭玉霞*，嚴學兵，張明，3

(1.河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州450002;2.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州225000;3.濮陽職業(yè)技術學院，河南 濮陽457000)

被譽為“牧草之王”[1]的苜蓿(Medicago sativa)中含有的生物活性物質(zhì)(苜蓿皂苷、苜蓿多糖和苜蓿黃酮)有以下作用，如抗氧化，抗菌，提高生長性能，提高免疫;而且苜蓿還可以作為人的保健品使用，如苜蓿飲料[2]。隨著研究的深入，對苜蓿生物活性物質(zhì)研究越來越多，尤為關注苜蓿黃酮。雖然黃酮的研究報道較多，但是苜蓿黃酮在動物上的研究比較少[3]。研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿黃酮可以改變奶牛瘤胃細菌的群落結(jié)構(gòu)和組成，進而影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化和代謝[4]。研究發(fā)現(xiàn)，通過體外培養(yǎng)法，厭氧條件下培養(yǎng)液中大豆異黃酮(異黃酮屬于黃酮類化合物)濃度為100 mg·L-1，對山羊瘤胃代謝影響最顯著[5]。研究表明，苜蓿黃酮可以穩(wěn)定瘤胃綿羊發(fā)酵功能，且受添加量影響[6]。

近幾十年來，養(yǎng)豬業(yè)由于抗生素的濫用，使豬腸道細菌產(chǎn)生了耐藥性和藥物殘留。因此，尋找一種抗生素替代品無藥物殘留、無耐藥性、無副作用的綠色添加劑成為近年來人們關注的熱點，其中植物提取物是研究的熱點之一。黃酮類化合物由于獨特的γ-吡喃苯環(huán)結(jié)構(gòu)，具有抗癌[7]，抗氧化[8-9]，抗菌[10]，促進脂類代謝[11]和類雌激素樣[12]等藥理作用，因其促進動物健康和提高生產(chǎn)性能而廣受關注。苜蓿黃酮在未來，很有可能作為一種綠色飼料添加劑、保健劑用于仔豬飼料中，使養(yǎng)豬業(yè)減少抗生素等藥物的應用，提高仔豬機體免疫力。

研究腸道微生態(tài)的方法很多，高通量測序技術可以全面的反應腸道微生態(tài)的豐度及多樣性的優(yōu)點而被廣泛應用于研究豬腸道微生物[13]。目前，苜蓿草粉和苜蓿黃酮對斷奶仔豬結(jié)腸微生物區(qū)系的影響研究未見報道。因此，本試驗通過16S r DNA高通量測序的方法研究苜蓿草粉和苜蓿黃酮對斷奶仔豬結(jié)腸微生物區(qū)系的影響。探討苜蓿黃酮是如何改變結(jié)腸微生物區(qū)系來影響仔豬腸道營養(yǎng)及消化代謝的，為苜蓿黃酮在仔豬中的應用提供一些參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

苜蓿黃酮購買于陜西綠清生物工程有限公司，黃色粉末，其中總黃酮含量為50%。

苜蓿草粉的主要營養(yǎng)成分:粗蛋白15.24%、粗脂肪2.7%、粗纖維21.6%、粗灰分9.3%、鈣1.4%、磷0.19%。

1.2 試驗設計

選取體重和胎次相近的(35±1)日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬120頭，隨機分成5組，每組3個重復，每個重復8頭豬，公母各占1/2。對照組飼喂不添加苜蓿草粉和苜蓿黃酮的基礎飼糧，試驗組分別添加1(Ⅰ組)、2(Ⅱ組)、4(Ⅲ組)g·kg-1苜蓿黃酮和50 g·kg-1苜蓿草粉(Ⅳ組)。試驗在許昌市許昌縣蘇橋鎮(zhèn)許昌緣自然農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司進行。試驗期間所有仔豬都是自由采食、自由飲水，并且按照豬場的常規(guī)管理程序驅(qū)蟲、消毒、免疫防疫，預試驗期3 d，正式試驗期32 d。試驗期間的基礎飼料由鄭州市大北農(nóng)飼料科技有限公司提供。飼料原料包括:玉米、發(fā)酵豆粕、膨化豆粕、大豆?jié)饪s蛋白、乳清粉、魚粉、豆油、氯化鋅、石粉、氨基酸、氨基酸鹽及其類似物、礦物質(zhì)元素及其螯合物、乳豬0.5%復合預混合飼料(大北農(nóng)集團)。

1.3 樣品采集

試驗樣品采集時間為2017年11月。在試驗最后一天，對每組每個重復隨機選取一頭豬頸部放血致死，解剖腹部，找到腸道的結(jié)腸部位并用酒精浸泡過的繩子結(jié)扎兩端，然后用生理鹽水沖洗結(jié)腸表面，用紗布蘸干水分，用手術刀剪開腸道，將內(nèi)容物擠到5 m L凍存管里面，立刻放入液氮罐，帶回實驗室-80℃保存。

1.4 結(jié)腸微生物DNA提取及PCR擴增

將樣品在干冰保存下送至上海美吉生物醫(yī)藥有限公司，根據(jù)FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒說明書步驟進行總DNA的抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop 2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量;用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增，擴增程序為:95℃預變性3 min，27個循環(huán)(95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸30 s)，最后72℃延伸10 min(PCR儀:ABI Gene Amp?9700型)。擴增體系為20μL，4μL 5×Fast-Pfu緩沖液，2μL 2.5 mmol·L-1dNTPs，0.8μL引物(5μmol·L-1)，0.4μL FastPfu聚合酶;10 ng DNA模板。

1.5 Illumina Miseq測序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST(Promega，USA)進行檢測定量。構(gòu)建文庫步驟:1)通過PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標區(qū)域外端;2)使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物;3)Tris-HCl緩沖液洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測;4)氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。

測序的原理是邊合成邊測序，同時DNA擴增表面讀取DNA片段。首先把各個樣本放在流通槽里同時在Illumina測序平臺進行分析;DNA雙鏈與引物進行連接至片段DNA兩端;變性退火變成的DNA單鏈和引物隨機的將一端固定在流通槽內(nèi)表面上;添加未被標記的堿基以及相應的酶進行固相橋型配對，然后進行橋型擴增;變性退火變成單鏈DNA;PCR擴增，在流通槽各個通路中產(chǎn)生密集的雙鏈DNA簇;將雙鏈DAN變性退火變成單鏈;加入標記過的d NTP、引物、DNA聚合酶，進行第一個測序循環(huán);在激光照射后，捕捉第一輪反應的堿基;去掉阻斷基團和熒光基團，進行第二個測序循環(huán);統(tǒng)計熒光標記堿基，將數(shù)據(jù)分析對比得到DNA片段序列(圖1)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

MiSeq測序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，首先根據(jù)PE reads之間的overlap關系，將成對的reads拼接(merge)成一條序列，同時對reads的質(zhì)量和merge的效果進行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向，即為優(yōu)化數(shù)據(jù)。通過i-Sanger云分析平臺對優(yōu)化數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，根據(jù)序列相似度為97%的原則，將序列分為多個操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)。通過(http://www.i-sanger.com/)云平臺進行細菌群落豐富度和多樣性分析、物種組成分析、樣本比較分析和物種差異分析。

采用Excel進行數(shù)據(jù)整理，采用(http://www.i-sanger.com/)云平臺物種差異分析中的單因素方差分析進行差異顯著性檢驗，數(shù)據(jù)均以均值±標準差表示(細菌門只以均值表示)，以P＜0.05為差異顯著性判斷標準。

圖1 PCR擴增電泳Fig.1 PCR amplification electrophoretogram

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿草粉和苜蓿黃酮對結(jié)腸細菌豐富度和多樣性的影響

試驗經(jīng)i-Sanger云平臺優(yōu)化后，共得到595701條優(yōu)化序列，優(yōu)化堿基數(shù)目為260613951，平均序列長度為437 nt。與對照組相比，試驗Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的優(yōu)化序列呈先升高后降低再升高趨勢，其中Ⅲ組顯著提高(P＜0.05);與對照組相比，Ⅳ組優(yōu)化序列顯著降低(P＜0.05)。從圖2可知，各個樣品的稀釋曲線趨于平緩，隨著測序深度的增加，OTU水平的Sobs指數(shù)將不再增加，說明測序數(shù)量比較合理。基于97%相似性的原則進行OTU分析(圖3)，5個組共產(chǎn)生484個OTUs，各組分別產(chǎn)生OTU數(shù)量為418(對照組)、463(Ⅰ組)、379(Ⅱ組)、446(Ⅲ組)、406(Ⅳ組)，其中共享327個OTUs，占總OTU數(shù)量的67.56%。從表1中可知，Sobs指數(shù)中各組之間OTU實際觀測值無顯著差異(P＞0.05);與對照組相比，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組ACE指數(shù)都有上升，其中Ⅰ組顯著高于對照組(P＜0.05);Chao指數(shù)Ⅰ組顯著高于對照組(P＜0.05)。各組中的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)都無顯著差異(P＞0.05)。說明苜蓿黃酮可以影響結(jié)腸細菌豐富度，其中試驗Ⅰ組效果最為明顯。

2.2 苜蓿草粉和苜蓿黃酮對結(jié)腸細菌組成和結(jié)構(gòu)的影響

圖2 每個樣品的稀釋曲線Fig.2 Rare faction curves of all samples

圖3 OTU維恩圖Fig.3 OTU venn

表1 苜蓿黃酮和苜蓿草粉對結(jié)腸細菌豐富度和多樣性的影響Table 1 Effect of alfalfa flavonoids and alfalfa meal on the richness and diversity of bacteria in the colon

表2 苜蓿黃酮和苜蓿草粉對結(jié)腸細菌組成和結(jié)構(gòu)的影響(門水平)Table 2 Effect of alfalfa flavonoids and alfalfa meal on composition and structure of bacteria in the colon(at the phyla level)

表3 苜蓿黃酮和苜蓿草粉對結(jié)腸細菌組成和結(jié)構(gòu)的影響(屬水平)Table 3 Effect of alfalfa flavonoids and alfalfa meal on composition and structure of bacteria in the colon(at the genus level)

圖4 每個樣品結(jié)腸細菌菌群分析(門水平)Fig.4 Bacteria in the colon microflora analysis(at the phyla level)

圖5 每個樣品結(jié)腸細菌菌群分析(屬水平)Fig.5 Bacteria in the colon microflora analysis(at the genus level)

圖6 多組間的差異分析Fig.6 Variance analysis in groups

在門水平上(表2)，與對照組相比，試驗Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的厚壁菌門相對豐度呈曲線升高而擬桿菌門相對豐度呈曲線下降。苜蓿草粉和苜蓿黃酮對其他菌門相對豐度均無顯著影響(P＞0.05)。在屬水平上(表3)，UCG-014、Erysipelotrichaceae和胃球菌屬相對豐富度各組間差異顯著(P＜0.05)，Anaerotruncus相對豐度各組間差異極顯著(P＜0.01)。與對照組相比，Ⅰ組、Ⅲ組和Ⅳ組的梭菌屬相對豐度顯著提高(P＜0.05)。與對照組相比，試驗Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的乳酸菌屬相對豐度呈先下降再上升再下降趨勢。與對照組相比，試驗Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的鏈球菌屬相對豐度呈線性升高，Ⅱ組升高效果較好(P＞0.05);糞球菌屬相對豐度呈線性升高，Ⅱ組顯著提高(P＜0.05)。與對照組相比，試驗Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的N K 3B 31、S24-7、Alloprevotella、Blautia、擬桿菌屬、氏菌屬相對豐度呈曲線下降(P＞0.05);真細菌屬和Anaerotruncus的相對豐度中Ⅱ組顯著提高(P＜0.05);NC2004相對豐度中Ⅲ組顯著提高(P＜0.05)。以上結(jié)果說明，苜蓿草粉和苜蓿黃酮對結(jié)腸細菌群落組成和結(jié)構(gòu)具有一定影響作用(圖4～6)。

3 討論

動物腸道內(nèi)微生物的數(shù)量龐大，種類多，是構(gòu)成動物必要的穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)，對病原菌的入侵有屏障作用，對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收有促進作用[14]。斷奶仔豬微生態(tài)系統(tǒng)容易受生理、環(huán)境、營養(yǎng)等應激的影響而發(fā)生變化，導致疾病發(fā)生[15]。高通量測序技術可以快速高效地了解微生物群落結(jié)構(gòu)和種類，更全面地了解苜蓿草粉和苜蓿黃酮對斷奶仔豬結(jié)腸微生物區(qū)系的影響。

Sobs指數(shù)是用來估算OTU實際觀測值，觀測值升高后趨于水平說明測序數(shù)量比較合理。Chao指數(shù)是用來估計樣本中OTU數(shù)目的指數(shù)，Chao指數(shù)越大，說明物種豐富度越大。ACE指數(shù)也是用來估計OTU數(shù)目的指數(shù)。Shannon和Simpson指數(shù)是用來估算微生物多樣性的。Shannon指數(shù)越大，說明微生物多樣性越高;Simpson指數(shù)越大，說明微生物多樣性越低。試驗中，各組之間的Shannon和Simpson指數(shù)趨于平衡，說明苜蓿草粉和苜蓿黃酮對斷奶仔豬結(jié)腸微生物多樣性無顯著影響。試驗結(jié)果表明，各試驗組中仔豬結(jié)腸內(nèi)厚壁菌門和擬桿菌門是優(yōu)勢菌門，這兩菌門占總菌門的95%以上。研究表明[16]，厚壁菌門和擬桿菌門是仔豬糞便中含量最高的菌門，本試驗結(jié)果與此相符。陳強等[17]研究表明，斷奶仔豬腸道中厚壁菌門和擬桿菌門可對腸道中代謝碳水化合物發(fā)酵發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，腸道中某些擬桿菌門細菌基因組中有編碼碳水化合物活性酶的基因，這些編碼的酶類可以降解多糖[18]。所以，厚壁菌門和擬桿菌門在斷奶仔豬結(jié)腸腸道中起著至關重要的作用。

在屬水平中，乳酸菌屬屬于優(yōu)勢菌屬，是一種有益菌屬，是能治療奶牛生殖道疾病的抗生素替代物之一[19]。從試驗數(shù)據(jù)來看，添加苜蓿草粉和添加苜蓿黃酮對仔豬結(jié)腸微生物中的乳酸菌屬有增加的可能。隨著苜蓿黃酮添加量的增加，梭菌屬的相對豐度都有增加，但Ⅱ組相對豐度增加不顯著，說明Ⅱ組可能有抑制梭菌屬的作用。凌代文[20]研究發(fā)現(xiàn)梭菌屬可以發(fā)酵多種碳水化合物。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸碳水化合物被發(fā)酵產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸(short chain fatty acid，SCFA)，如乙酸、丙酸和丁酸等，而蛋白質(zhì)降解和氨基酸發(fā)酵產(chǎn)物也是SCFA，梭菌屬經(jīng)丙烯酸發(fā)酵丙氨酸產(chǎn)生丁酸，同時也可以在蘇氨酸脫氫酶作用發(fā)酵蘇氨酸產(chǎn)生丙酸[21]，說明梭菌屬參與結(jié)腸發(fā)酵活動。從試驗中可知，苜蓿草粉和黃酮可以顯著提高梭菌屬相對豐度，影響結(jié)腸細菌發(fā)酵碳水化合物，進而影響碳水化合物消化代謝。苜蓿黃酮梯度組和苜蓿草粉組中Blautia相對豐度與對照組相比有降低，說明苜蓿草粉和苜蓿黃酮對Blautia有可能起到抑制作用。本試驗與占今舜等[4]研究表明苜蓿黃酮對Blautia很可能產(chǎn)生抑制作用結(jié)果相一致。NK 3B 31和Prevotella 9都屬于普氏菌屬，這兩菌屬的相對豐度中，苜蓿黃酮梯度組相比于對照組都有降低的可能?？紫榻艿萚22]研究表明，普氏菌屬有降解半纖維素的作用。占今舜等[4]研究表明，苜蓿黃酮可能有提高普氏菌屬數(shù)量的作用。從本試驗結(jié)果來看，苜蓿草粉和苜蓿黃酮都很有可能提高胃球菌屬的相對豐度，試驗Ⅲ組對胃球菌屬很有可能起到抑制作用?？紫榻艿萚22]研究發(fā)現(xiàn)，胃球菌屬可以利用日糧纖維物質(zhì)提供的能量來維持自身生長繁殖需要。王鵬[23]研究發(fā)現(xiàn)，胃球菌屬和普氏菌屬都具有分解纖維類物質(zhì)的能力。綜上所述，苜蓿草粉和黃酮能夠改變結(jié)腸微生物細菌組成和結(jié)構(gòu)，進而影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化代謝。

4 結(jié)論

飼糧中添加苜蓿黃酮可以顯著影響斷奶仔豬結(jié)腸細菌豐富度且0.1%苜蓿黃酮組影響較大，添加50 g·kg-1苜蓿草粉對斷奶仔豬結(jié)腸細菌豐富度影響作用不明顯。添加苜蓿草粉和添加苜蓿黃酮對斷奶仔豬結(jié)腸細菌的多樣性無顯著影響。

在門水平上，隨著苜蓿黃酮添加量的增加，優(yōu)勢菌門中，厚壁菌門相對豐度有提高的可能而擬桿菌門有降低的趨勢;添加5%苜蓿草粉組，厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度均無顯著差異。在屬水平上，添加一定量的苜蓿黃酮可以顯著提高梭菌屬、糞球菌屬、真細菌屬、NC2004屬、Anaerotruncus屬細菌的相對豐度而有降低N K 3B 31屬、Alloprevotella屬、Blautia屬、擬桿菌屬的相對豐度的可能;添加50 g·kg-1苜蓿草粉可以顯著提高Anaerotruncus屬、梭菌屬的相對豐度而有降低Blautia屬、氏菌屬相對豐度的可能。