王超，康翠翠，馮江銀，縣怡涵，虞德夫，朱偉云，杭蘇琴

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家動物消化道國際聯(lián)合研究中心，動物科技學(xué)院，江蘇 南京210095)

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)，在生命活動的調(diào)節(jié)及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重要作用。哺乳動物每天必須攝入一定量的氨基酸來滿足機體需求，飼糧中氨基酸水平的變化會影響動物的食欲及動物生產(chǎn)性能。胃腸道是機體最大的內(nèi)分泌器官，分布有多種內(nèi)分泌細(xì)胞，包括胃G、D細(xì)胞及腸I、K、L細(xì)胞等[1]。在這些細(xì)胞上分布的營養(yǎng)感應(yīng)體通過感應(yīng)日糧中的營養(yǎng)物質(zhì)，介導(dǎo)胃腸飽感激素分泌，通過腦腸軸調(diào)節(jié)胃腸道蠕動、胃酸分泌、血糖平衡以及飽腹感等生理反應(yīng)[2]。

研究表明，鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)作為氨基酸感應(yīng)體的一員，在人及大鼠的胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞中廣泛表達，不僅參與胃腸道營養(yǎng)素的吸收和代謝，同時可通過感應(yīng)多種蛋白水解物如L-氨基酸、陽離子多肽等介導(dǎo)胃腸激素分泌而受到廣泛關(guān)注[3]。Zhao等[4]報道，CaSR可介導(dǎo)L-色氨酸(L-Trp)刺激豬十二指腸分泌膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)和葡萄糖依賴性促胰島素多肽(glucose-dependent insulinotropic peptide，GIP)。Xian等[5]在豬胃上的研究發(fā)現(xiàn)，CaSR可介導(dǎo)L-Trp和L-苯丙氨酸(L-Phe)調(diào)控胃泌素(gastrin)和生長激素抑制素(somatostatin)分泌。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，條件性必需氨基酸L-精氨酸(L-Arg)可通過CaSR促進大鼠小腸GIP、胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)等胃腸飽感激素分泌[6]。研究表明，這些胃腸飽感激素再通過血液或迷走神經(jīng)作用于腦部與食欲調(diào)節(jié)相關(guān)的區(qū)域，調(diào)節(jié)下丘腦弓形核上的抑制采食的阿片促黑色素原(pro-opiomelanocortin，POMC)以及促進采食的神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)等的表達和機體的飽腹感[7]。上述很多研究都在體外進行，條件單一，而體內(nèi)環(huán)境更復(fù)雜。因此，進一步研究氨基酸在體內(nèi)對胃腸激素分泌、胃腸道CaSR基因表達及機體食欲的影響十分必要。Alamshah等[8]通過給小鼠回腸灌注L-Phe發(fā)現(xiàn)，小鼠采食量顯著下降，血液中GLP-1和酪酪肽(peptide YY，PYY)的含量顯著升高。當(dāng)加入CaSR抑制劑后，小鼠采食量恢復(fù)正常。該研究表明，小鼠采食量下降可能是L-Phe通過CaSR誘導(dǎo)胃腸激素分泌引起的。Jordi等[9]通過給大鼠分別口服17種氨基酸發(fā)現(xiàn)，效果最顯著的3種厭食性氨基酸分別是L-精氨酸、L-賴氨酸和L-谷氨酸。根據(jù)前人的研究，我們假設(shè)L-Arg可通過CaSR誘導(dǎo)胃腸激素分泌，影響大鼠采食。因此，本試驗以大鼠為研究對象，通過給大鼠灌胃L-Arg，以探究其對大鼠胃腸道CaSR表達、胃腸激素分泌及采食的影響，為氨基酸調(diào)控機體采食的機制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選擇體重為180～220 g的2月齡SD(SD大鼠，sprague-dawley rat)雄性大鼠32只。每只大鼠單籠飼養(yǎng)，鼠房溫度20～25℃，保持12 h光照循環(huán);自由采食飲水，提供嚙齒動物標(biāo)準(zhǔn)顆粒料。飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)符合我國《實驗動物管理條例》。大鼠及顆粒料均購自南京市青龍山動物繁殖中心。

1.2 試驗設(shè)計及樣品采集

1.2.1 試驗I:灌胃不同濃度精氨酸對大鼠采食的影響 試驗于2017年4月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實驗基地進行。大鼠在室溫下適應(yīng)環(huán)境及日糧一周后，按照體重相近原則隨機分為4個劑量組，每組8只。L-Arg·HCl低劑量組(5 mmol·kg-1)、中劑量組(10 mmol·kg-1)、高劑量組(20 mmol·kg-1)及對照組(0 mmol·kg-1)。進行灌胃時，左手將大鼠從籠中取出使大鼠呈直立狀，頭部后仰，嘴巴向上張開，右手拿起預(yù)先裝有灌胃液的注射器，使灌胃針順著大鼠上頜部向內(nèi)伸入食道，將灌胃液注入食道使其進入胃部。大鼠灌胃前禁食12 h(6:00-18:00)，每只大鼠灌胃總體積為2.5 m L。灌胃結(jié)束后，飼喂預(yù)先稱量好的標(biāo)準(zhǔn)顆粒料，記錄并計算灌胃后0～1 h、1～2 h、2～4 h及0～24 h內(nèi)大鼠的采食量。根據(jù)采食量結(jié)果篩選出對大鼠采食影響顯著的L-Arg最適劑量，用于大鼠一周灌胃試驗。L-Arg·HCl購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2.2 試驗II:灌胃精氨酸一周對大鼠胃腸激素分泌、CaSR基因表達、采食量及體重的影響 另選30只雄性大鼠適應(yīng)環(huán)境一周，按照體重相近原則隨機分為2組，L-Arg·HCl高劑量組(20 mmol·kg-1)及對照組(0 mmol·kg-1)，灌胃大鼠一周(每天一次)。在此期間，記錄大鼠初始體重、終體重并計算體重變化，每天記錄采食量。一周后眼球靜脈采血，血液凝固后以3500 r·min-1離心10 min取上層血清，-20℃冷凍保存，用于胃泌素(gastrin)、膽囊收縮素(CCK)、葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)及胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)的檢測。采血后脊椎脫臼處死，立即打開腹腔取出胃腸道，根據(jù)解剖學(xué)區(qū)分部分組織，冰上剪取胃、十二指腸、空腸及回腸中段組織，磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffered saline，PBS)漂去腸內(nèi)容物;打開頭骨，采集下丘腦，所有組織剪碎置于液氮保存，檢測胃腸道CaSR及下丘腦厭食因子POMC及促食因子NPY(神經(jīng)肽Y，neuropeptide Y)的基因表達。

1.3 指標(biāo)測定及方法

1.3.1 血清胃腸激素含量的測定 嚴(yán)格按照大鼠Gastrin、CCK、GIP及GLP-1的試劑盒說明書利用酶標(biāo)儀(infiniteF50，TECAN，瑞士)檢測大鼠血清中的胃腸激素含量。大鼠Gastrin(型號:ANG-E12225R-1，檢測范圍:2～50 ng·L-1，板內(nèi)差異＜9%，板間差異＜15%)，CCK(型號:ANG-E11530R-1，檢測范圍:10～200 ng·L-1，板內(nèi)差異＜9%，板間差異＜15%)，GIP(型號:ANG-E11427R-1，檢測范圍:80～2400 pg·m L-1，板內(nèi)差異＜9%，板間差異＜15%)，及GLP-1(型號ANG-E11115R-1，檢測范圍:0.2～4.0 pmol·L-1，板內(nèi)差異＜9%，板間差異＜15%)，試劑盒均購自南京奧青生物技術(shù)有限公司。

1.3.2 總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR

根據(jù)RNA快速提取試劑盒(RNApure Total RNA Kit，RN03，北京艾德萊生物科技有限公司)說明書提取大鼠胃、十二指腸、空腸、回腸及下丘腦的總RNA，反轉(zhuǎn)錄體系及反應(yīng)條件嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT reagent Kit with gDNA Eraser，RR047A，大連寶生物工程有限公司)操作說明進行。

根據(jù)參考文獻[10-12]中大鼠CaSR、POMC、NPY以及GAPDH序列合成引物，引物信息見表1。以cDNA為模板，采用SYBR GreenⅡ染料試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTM，RR420A，大連寶生物工程有限公司)在Step OnePlus 2.2.2(Life Techhnologies，美國)上進行實時熒光定量PCR。反應(yīng)體系包括:SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNase H Plus)(2×)10μL，上、下游引物各0.4μL，ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，cDNA模板2μL，dd H2O 6.8μL。PCR反應(yīng)程序為:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，40 cycles;95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。每個樣品3個重復(fù)，采用2-△△Ct法計算各基因的相對表達量。

表1 相關(guān)基因的引物序列Table 1 Primer sequences of related genes

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0(IBM公司，美國)統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，各檢測指標(biāo)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。單因素方差模型One-way ANOVA分析試驗I結(jié)果，S-N-K test檢驗差異顯著性;獨立樣本t檢驗分析試驗II結(jié)果，F(xiàn)-test檢驗方差同質(zhì)性。P＜0.05為差異顯著。Pearson模型分析血清中胃腸激素濃度與胃腸道CaSR及下丘腦POMC、NPY基因表達的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)用R表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 灌胃精氨酸對大鼠采食量及體重的影響

從圖1A可以看出，與對照組相比，灌胃10及20 mmol·kg-1L-Arg·HCl后0～1 h內(nèi)，大鼠的采食量分別下降了46.0% 和60.9%(P＜0.05);在1～2 h及2～4 h內(nèi)，各組之間無顯著差異;在0～24 h內(nèi)，分別下降了16.0%和23.1%。說明灌胃20 mmol·kg-1L-Arg·HCl溶液對大鼠采食量的影響顯著。

根據(jù)上述結(jié)果，接下來給大鼠灌胃20 mmol·kg-1L-Arg·HCl一周，初步探究精氨酸對采食的影響是否長期存在，最終是否影響大鼠體重。結(jié)果如圖1B所示，與對照組相比，20 mmol·kg-1L-Arg·HCl顯著降低了大鼠0～1 d和0～2 d的累加采食量(P＜0.05)，0～7 d的采食量有降低的趨勢。大鼠體重變化如圖1C所示，與對照組相比，20 mmol·kg-1L-Arg·HCl顯著降低了大鼠體增重(P＜0.05)。

圖1 灌胃不同濃度精氨酸對大鼠0～24 h內(nèi)采食量(A)及灌胃精氨酸一周對大鼠采食量(B)和體重(C)的影響Fig.1 Effect of oral gavage of different concentrations of L-Arg·HCl on feed intake of 0-24 h in rats(A)and effect of oral gavage 1 week of 20 mmol·kg-1 L-Arg·HCl on feed intake(B)and body weight(C)in rats

2.2 灌胃精氨酸對大鼠血清胃腸激素的影響

從圖2可以看出，與對照組相比，灌胃20 mmol·kg-1L-Arg·HCl一周，血液中CCK的濃度顯著升高(P＜0.05);Gastrin和GIP的濃度有升高的趨勢(P=0.06);而GLP-1的濃度沒有顯著變化。

2.3 灌胃精氨酸對大鼠胃及小腸CaSR表達的影響

如圖3所示，與對照組相比，灌胃20 mmol·kg-1的L-Arg·HCl顯著提高大鼠胃、十二指腸、空腸及回腸中CaSR的基因表達水平(P＜0.05)。說明，精氨酸可以激活分布于胃及小腸上的CaSR。

2.4 灌胃精氨酸對大鼠下丘腦食欲調(diào)節(jié)因子基因表達的影響

結(jié)果如圖4所示，與對照組相比，灌胃20 mmol·kg-1L-Arg·HCl一周后，POMC基因相對表達量顯著升高(P＜0.05)，NPY無顯著差異(P＞0.05)。表明L-Arg可能是通過促進厭食因子的表達，進而下調(diào)大鼠采食量。

圖2 灌胃精氨酸對大鼠胃腸激素分泌的影響Fig.2 Effect of oral gavage of L-Arg·HCl on the gut hormone secretion in rats

圖3 灌胃精氨酸對大鼠胃及小腸CaSR表達的影響Fig.3 Effect of oral gavage of L-Arg·HCl on mRNA expression of CaSR in the stomach and small intestine of rats

圖4 灌胃精氨酸對大鼠下丘腦食欲調(diào)節(jié)因子POMC和NPY基因表達的影響Fig.4 Effect of oral gavage of L-Arg·HCl on mRNA expression of POMC and NPY in the hypothalamic neurons of the rats

2.5 大鼠胃腸激素與胃腸道CaSR及下丘腦POMC和NPY基因表達的相關(guān)性分析

由表2可以看出，血清Gastrin濃度與胃中CaSR基因表達量呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，與下丘腦食欲調(diào)節(jié)因子POMC、NPY無顯著相關(guān)性(P＞0.05);CCK濃度與十二指腸、空腸CaSR及下丘腦POMC基因表達量呈顯著正相關(guān)(P＜0.05);GIP濃度與十二指腸CaSR及下丘腦POMC基因表達量呈顯著正相關(guān)(P＜0.05);GLP-1濃度與空腸CaSR及下丘腦POMC基因表達量有正相關(guān)的趨勢(0.05＜P＜0.1)。

表2 大鼠血清胃腸激素與胃腸道CaSR及下丘腦POMC和NPY基因表達的相關(guān)性分析Table 2 Correlation of the concentration of gut hormone in serum with the gene expression level of CaSR in gastrointestinal tract and POMC,NPY in hypothalamus of rats

3 討論

3.1 灌胃精氨酸對大鼠采食量及體重的影響

蛋白質(zhì)為動物生長提供了重要的能源物質(zhì)，然而有研究發(fā)現(xiàn)，長期高蛋白飲食會促進機體產(chǎn)生飽腹感并導(dǎo)致體重下降[13]。Veldhorst等[14]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)引起的飽腹感主要與其在胃腸道水解產(chǎn)生的氨基酸及小肽有關(guān)。Jordi等[9]發(fā)現(xiàn)，給大鼠灌胃6.7 mmol·kg-1L-Arg溶液顯著降低了大鼠采食量;Greenwood[15]給小鼠腹腔注射4 mmol·kg-1L-Arg顯著降低小鼠采食量;當(dāng)給大鼠灌胃4 mmol·kg-1L-Arg溶液，大鼠采食量在0～1 h內(nèi)有下降的趨勢但不顯著。說明，一定劑量的精氨酸與采食有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，5 mmol·kg-1的L-Arg·HCl溶液對大鼠采食沒有影響，10 mmol·kg-1以上的濃度顯著降低大鼠的采食量，且采食量的降低與L-Arg·HCl的濃度存在線性劑量依賴效應(yīng)。而且，大鼠在灌胃后1 h采食量下降顯著，在1～2 h和2～4 h內(nèi)各組間的采食量沒有顯著差異。Alamshah等[8]給大鼠灌胃L-Phe同樣發(fā)現(xiàn)，大鼠在0～1 h內(nèi)采食量下降最顯著。說明氨基酸對采食量的影響可能與胃腸飽感激素對機體采食的調(diào)節(jié)有關(guān)，飽感激素主要在短期內(nèi)顯著分泌并發(fā)揮作用，其濃度可在分泌后幾十分鐘內(nèi)顯著降低[16]，從而導(dǎo)致采食量在0～1 h下降最顯著。此外，本試驗灌胃一周L-Arg·HCl顯著降低大鼠體增重及0～2 d的累加采食量，0～7 d的累加采食量呈下降趨勢，表明大鼠體增重的減少與采食量的降低有關(guān)。Clemmensen等[17]研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠長期補充L-Arg會減少白色脂肪組織的增加，表明大鼠體增重的減少還可能與白色脂肪組織的減少有關(guān)，其具體的影響機制需要進一步的深入研究。

3.2 灌胃精氨酸對大鼠胃腸道CaSR基因表達及胃腸激素分泌的影響

CaSR作為胃腸道重要的氨基酸感應(yīng)體，在感應(yīng)蛋白水解物以及介導(dǎo)胃腸激素分泌中起著重要的作用。趙秀英等[18]研究發(fā)現(xiàn)降低日糧蛋白水平后，豬小腸CaSR基因表達下降，并伴隨著血清中CCK、GIP、GLP-1等胃腸激素含量的降低。與上述結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示，大鼠灌胃L-Arg顯著提高了胃和小腸中CaSR基因的表達，促進了Gastrin、CCK和GIP的分泌。有研究報道，CaSR在胃腸道中的G、I、K及L細(xì)胞等內(nèi)分泌細(xì)胞中均有表達[3]。本試驗相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，胃中CaSR的表達與血液中Gastrin的含量呈顯著正相關(guān)，十二指腸和空腸中CaSR表達與CCK的濃度呈顯著正相關(guān)，十二指腸CaSR表達與血液中GIP濃度呈顯著正相關(guān)，這可能與Gastrin主要由胃竇G細(xì)胞分泌，CCK主要由存在于十二指腸和空腸的I細(xì)胞分泌，GIP主要由存在于近端小腸的K細(xì)胞分泌有關(guān)[19]。前期的體外研究結(jié)果顯示，當(dāng)用L-Arg對豬十二指腸進行灌流時，可顯著促進CCK、GIP分泌;然而當(dāng)加入CaSR抑制劑NPS 2143后，氨基酸引起的激素促分泌作用消失[20]。以上結(jié)果說明L-Arg引起的胃腸激素分泌可能是CaSR介導(dǎo)引起的。本試驗還發(fā)現(xiàn)，GLP-1的分泌無顯著變化，然而有研究發(fā)現(xiàn)，L-Arg可以誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)或離體L細(xì)胞GLP-1的分泌[21];另有研究表明，腸道感應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)后15～30 min出現(xiàn)GLP-1瞬時分泌高峰，在60～90 min再次達到高峰[22]。本試驗中GLP-1分泌無顯著變化可能是由于本試驗在灌胃后30 min采集血液，因而未檢測到GLP-1的分泌高峰。

3.3 灌胃精氨酸對大鼠下丘腦食欲調(diào)節(jié)因子的影響

食欲調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，下丘腦作為食欲調(diào)節(jié)中樞在機體采食中起重要調(diào)節(jié)作用。Sam等[23]報道，內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的激素可以通過血腦屏障到達下丘腦，與下丘腦中相關(guān)激素受體相結(jié)合，傳遞促/厭食信號;或者通過與迷走神經(jīng)上的激素受體相結(jié)合將促/厭食信號傳達至下丘腦弓狀核或腦干，激活攝食相關(guān)因子如厭食因子POMC、安非他明調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子(cocaine and amphetamine regulated transcript，CART)和促食相關(guān)因子NPY及野鼠相關(guān)肽(agouti gene-related protein，AgRP)，從而激活室旁核和外側(cè)下丘腦區(qū)域的腎上腺皮質(zhì)素受體3和4，調(diào)控機體采食量。本試驗對NPY和POMC的基因表達進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，厭食因子POMC的表達量顯著升高，NPY沒有顯著變化;且相關(guān)性分析表明CCK及GIP的濃度與POMC基因表達量呈顯著正相關(guān)。這可能是由于L-Arg刺激飽感激素分泌后，激素與下丘腦激素受體結(jié)合或通過與迷走神經(jīng)激素受體結(jié)合后將厭食信號傳遞至下丘腦，下丘腦接收信號后激活厭食因子POMC，從而使POMC基因表達上調(diào)。隋嘯一等[24]給家兔飼喂高蛋白日糧發(fā)現(xiàn)，十二指腸中CCK及下丘腦弓形核中厭食因子CART和POMC的基因表達顯著升高。Fan等[25]在小鼠上研究發(fā)現(xiàn)，CCK可通過調(diào)節(jié)下丘腦POMC神經(jīng)元降低小鼠的采食。本研究中胃腸激素CCK顯著分泌，伴隨著POMC表達量的顯著升高，與以上研究結(jié)果一致，進一步說明飽感激素CCK與下丘腦厭食因子POMC存在一定關(guān)系。然而飽感激素與下丘腦食欲調(diào)節(jié)因子之間的直接關(guān)系尚需進一步驗證。有研究表明，NPY作為促進食欲調(diào)節(jié)的重要神經(jīng)元，其表達量會隨著機體對能量需求的增強而升高[26]，在本試驗中大鼠可隨時獲取食物，沒有產(chǎn)生明顯饑餓感，這可能導(dǎo)致了灌胃精氨酸沒有顯著影響大鼠NPY基因的表達。

4 結(jié)論

灌胃20 mmol·kg-1L-Arg顯著降低了大鼠采食量及體增重，促進CCK等胃腸激素的分泌，提高了胃和小腸中CaSR及下丘腦厭食因子POMC的基因表達。相關(guān)性分析結(jié)果表明，灌胃L-Arg后，大鼠血液中Gastrin濃度與胃中CaSR基因表達呈顯著正相關(guān)，CCK濃度與十二指腸、空腸CaSR、下丘腦POMC基因表達呈顯著正相關(guān)，GIP濃度與十二指腸CaSR和下丘腦POMC基因表達呈顯著正相關(guān)。