楊成德，崔月貞，馮中紅，薛莉，金夢軍

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，甘肅 蘭州730070;2.甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州730070)

植物內(nèi)生細菌(Endophytic bacteria)不僅將植物作為其棲息場所，也能通過合成或促使植物合成如生長素和細胞分裂素等多種植物生長激素促進根系吸收水分和養(yǎng)分從而促進植物生長[1]，如秦娟娟等[2]報道，經(jīng)內(nèi)生細菌處理的辣椒(Capsicum annuum)株高、根長、鮮重和干重均顯著高于對照，其中干重增加率為109.03%～140.63%，張芳芳等[3]報道內(nèi)生細菌對植物株高和根長有顯著促進作用;另外，內(nèi)生細菌主要通過影響宿主植物的物質(zhì)代謝，形成生理活性物質(zhì)來改變植株的生理特性，從而提高植物的抗逆性，如Bin等[4]報道在禾本科植物芒草(Miscanthus sinensis)上接種內(nèi)生固氮菌能減少鹽脅迫的傷害，提高芒草的耐鹽性;羅達等[5]報道接種內(nèi)生固氮菌的植株葉內(nèi)酶活性明顯高于未接菌植株，提高了多枝檉柳(Tamarix ramosissima)植株在水鹽脅迫條件下的適應(yīng)能力和根系活力。因此，內(nèi)生細菌可以有效改善植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用效率，并可以通過影響植物的生理生化特性來增加植物的抗脅迫能力。

紫花針茅(Stipa capillata)是高寒草甸類草地的優(yōu)勢牧草之一，為多年生旱生草本植物，分布于我國華北、西北、青藏高原等地，特別是高寒草地的主要建群種[6]，其可以在高寒草地低溫和強紫外線等逆境條件下生存，這種抗逆能力是否與其內(nèi)生細菌有關(guān)?內(nèi)生細菌265ZY4菌株分離自東祁連山紫花針茅葉片，為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，在離體條件下具有溶解無機磷和產(chǎn)吲哚乙酸(indole acetic acid，IAA)能力，且對多種植物病原真菌有較好的拮抗效果[7]，但這些生物功能對宿主紫花針茅的抗逆能力有怎樣的影響并不明確。因此，本研究建立不帶內(nèi)生細菌的紫花針茅種群，并回接265ZY4菌株，選擇與高寒草地生境相似的低溫(4℃)和紫外線等脅迫，測定葉綠素、可溶性蛋白、可溶性糖的含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-iyase，PAL)的活性，以期明確內(nèi)生細菌265ZY4對逆境脅迫下紫花針茅生化特征的影響，為揭示內(nèi)生細菌的生物學(xué)功能及機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試內(nèi)生細菌:內(nèi)生枯草芽孢桿菌265ZY4由本課題組分離自高寒草地優(yōu)勢牧草紫花針茅葉片，保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院植物病原細菌及細菌多樣性實驗室。

1.2 方法

1.2.1 不帶內(nèi)生細菌紫花針茅種群培育和脅迫方法 2016年6月挑選籽粒飽滿、均一的紫花針茅種子，用0.1%升汞處理10 min，后用20%次氯酸鈉處理30 min，再溫湯浸種30 min，后置于水瓊脂培養(yǎng)基上催芽，選取萌芽一致并不帶菌的種子，播種于裝有營養(yǎng)一致的無菌營養(yǎng)土的50孔塑料育苗盤內(nèi)，置于控溫光照智能培養(yǎng)箱內(nèi)，光照強度為5000 lx，周期為12 h/12 h(晝/夜)，根據(jù)土壤濕度澆水，除高、低溫脅迫時間外均為25℃，待幼苗株高10 cm左右時，每孔灌根接種108cfu·g-1的內(nèi)生細菌菌液(將內(nèi)生細菌發(fā)酵液5000 r·min-1離心10 min后收集菌體并用無菌水配制)2 m L，以接等量清水為對照;15 d后對紫花針茅進行低溫(4℃)、高溫(40℃)和紫外線脅迫，每天4 h，在10:00-14:00進行;3次重復(fù);紫外線脅迫為將幼苗置于紫外光光照智能培養(yǎng)箱內(nèi)，紫外燈燈管距離幼苗50 cm，于254 nm紫外光下4 h，其他時間正常管理;對照為不接種內(nèi)生細菌，其他同處理。

1.2.2 測定指標(biāo)及方法 接菌處理后25 d隨機選擇30株紫花針茅測定株高和葉寬并計算平均值。

于第0、2、4、6和8天下午脅迫后1 h(下午3點)分別采集15株紫花針茅地上部分為樣品進行生理生化指標(biāo)測定，3次重復(fù)。葉綠素含量采用SPAD-502葉綠素測定儀測定;可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定[8];可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定[9];超氧化物歧化酶活性采用四唑氮藍NBT光化還原法測定[9];苯丙氨酸解氨酶活性參照高峻鳳[10]的方法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，作圖時以對照為縱坐標(biāo)0，相對對照增加在橫坐標(biāo)軸上方區(qū)域，降低在橫坐標(biāo)軸下方區(qū)域;采用Duncan氏新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細菌對紫花針茅株高和葉寬的影響

帶菌紫花針茅株高和葉寬分別為14.15和1.32 cm，較對照分別增加35.02%和34.69%(表1)，說明內(nèi)生細菌265ZY4對紫花針茅具有明顯的促生作用。

表1 內(nèi)生細菌265ZY4對紫花針茅株高和葉寬的影響Table 1 Effects of endophytic bacterium 265ZY4 on plant height and leaf width of S.purpurea(cm)

2.2 內(nèi)生細菌對紫花針茅葉綠素含量的影響

在低溫脅迫下第2和4天時帶菌紫花針茅葉綠素含量比處理前分別增加了7.4%和1.5%，而對照第2和4天比脅迫前分別下降了4%和11%，但第8天時帶菌與對照均下降了43.7%和44.8%，差異不顯著(圖1A);在高溫脅迫下第2、4和6天時帶菌紫花針茅葉綠素含量比處理前分別增加了36.6%、11.1%和10.2%，而對照第2、4和6天時分別比脅迫前下降了5.6%、11.3%和38.1%，但第8天時帶菌與對照分別下降17.0%和44.0%，處理和對照差異顯著(P＜0.05)(圖1B);在紫外線脅迫下，帶菌和對照均下降，第2天時分別下降10.0%和24.0%，差異顯著(P＜0.05)，之后帶菌處理與對照差異不顯著(圖1C)。該結(jié)果表明紫花針茅在脅迫期間葉綠量含量均下降，但除紫外線脅迫外帶菌紫花針茅葉綠素含量脅迫前期增長，后期下降，但下降率低于對照。

圖1 在低溫(A)、高溫(B)和紫外線(C)脅迫下紫花針茅葉綠素含量的變化率Fig.1 Change ratio of chlorophyll contents of S.purpurea after low temperature(A),high temperature(B)and ultraviolet stress(C)

2.3 內(nèi)生細菌對紫花針茅可溶性蛋白的影響

紫花針茅可溶性蛋白受低溫、高溫和紫外光脅迫后均上升，除帶菌紫外線脅迫外均在第6天達到最高，之后迅速下降;第2天時帶菌與對照變化率差異顯著(P＜0.05)，但之后除紫外線脅迫第6天變化率差異變小外，第8天時基本一致(圖2)。

圖2 低溫(A)、高溫(B)和紫外線(C)脅迫下紫花針茅可溶性蛋白的變化率Fig.2 Change ratio of soluble protein contents of S.purpurea after low temperature(A),high temperature(B)and ultraviolet stress(C)

2.4 內(nèi)生細菌對紫花針茅可溶性糖的影響

在低溫脅迫下帶菌紫花針茅可溶性糖呈先上升后下降趨勢，第4天達最大值，為5.20μg·g-1FW，對照呈下降趨勢，第2天為最大值，為4.81μg·g-1FW，對照和帶菌間差異顯著(P＜0.05);高溫脅迫下處理和對照均為第2天達最大值，分別為9.38和10.65μg·g-1FW，之后下降，第2、4和6天差異顯著(P＜0.05);在紫外線脅迫下，對照可溶性糖呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，第6天時最高，為5.10μg·g-1FW，比處理前上升了46.2%，第8天時明顯下降，僅比處理前增長3.0%;帶菌紫花針茅可溶性糖在第2天時下降了7.3%，之后上升，第6天時達到最大值6.21μg·g-1FW，比處理前增加了74.9%，第8天時開始下降，但比處理前增加33.5%(圖3)。

圖3 低溫(A)、高溫(B)和紫外線(C)脅迫下紫花針茅可溶性糖的變化率Fig.3 Change ratio of soluble sugar contents of S.purpurea after low temperature(A),high temperature(B)and ultraviolet stress(C)

對照在低溫、高溫和紫外線脅迫下第2天均顯著高于帶菌處理(P＜0.05)，之后除紫外線脅迫外均下降;帶菌紫花針茅在低溫和紫外線脅迫下第2天后繼續(xù)上升，分別在第4和6天達到最大值。該結(jié)果說明紫花針茅內(nèi)生細菌265ZY4在第2天后對宿主紫花針茅可溶性糖有促進作用。

2.5 內(nèi)生細菌對紫花針茅超氧化物歧化酶(SOD)的影響

在低溫和高溫脅迫下，帶菌紫花針茅和對照超氧化物歧化酶活性均呈現(xiàn)為脅迫后快速下降，第2天后酶活性又上升，至第6天達到最高，分別為298.56和299.22 U·g-1FW，第8天下降到最小值;在低溫脅迫下除第6天外，帶菌紫花針茅變化率顯著小于對照(P＜0.05);高溫脅迫下除第8天外，帶菌紫花針茅和對照變化率差異不顯著，但第6天酶活性高于處理前，且?guī)Ь匣ㄡ樏└哂趯φ?在紫外線脅迫下，帶菌紫花針茅呈先下降后上升趨勢，第8天時酶活性最高，為302.5 U·g-1FW，而對照第6天后開始下降，且?guī)Ь匣ㄡ樏㏒OD活性變化率除第8天外均顯著低于對照(P＜0.05)(圖4)。總體看，對照和帶菌紫花針茅(除帶菌紫外線脅迫外)均為第6天變化率位于相對較高位置，且?guī)Ь匣ㄡ樏┳兓市∮趯φ?但是，帶菌紫花針茅在紫外線脅迫下呈持續(xù)上升趨勢，且第6天酶活性低于脅迫前，第8天達最大值，而對照第2天低于脅迫前，第6天達到最大值，之后下降。

圖4 低溫(A)、高溫(B)和紫外線(C)脅迫下紫花針茅SOD活性的變化率Fig.4 Change ratio of SOD activity of S.purpurea after low temperature(A),high temperature(B)and ultraviolet stress(C)

2.6 內(nèi)生細菌對紫花針茅苯丙氨酸解氨酶(PAL)的影響

在低溫、高溫和紫外線脅迫下，帶菌紫花針茅和對照苯丙氨酸解氨酶活性變化率均呈先上升后下降的趨勢(圖5);帶菌紫花針茅和對照受低溫脅迫后PAL活性升高，第4天時PAL活性分別達到最高值368.9和302.4 U·g-1·min-1，脅迫第8天時帶菌紫花針茅和對照PAL活性均下降，但對照下降率高于帶菌植株(圖5A);紫花針茅PAL活性受高溫和紫外線脅迫后呈先降低后升高，再下降的趨勢，高溫脅迫第6天時PAL活性達到最高，對照和處理分別為295.3和290.2 U·g-1·min-1，而紫外線脅迫下對照第4天達到最大值，為277.1 U·g-1·min-1，處理第6天達到最大值，為294.1 U·g-1·min-1，第8天最低(圖5C)。

圖5 低溫(A)、高溫(B)和紫外線(C)脅迫下紫花針茅PAL活性的變化率Fig.5 Change ratio of PAL activity of S.purpurea after low temperature(A),high temperature(B)and ultraviolet stress(C)

3 討論與結(jié)論

植物內(nèi)生細菌通過其固氮、抑菌及產(chǎn)生生物活性物質(zhì)等生物功能，增強宿主植物的抗病性、抗蟲性、抗旱性和提高生長競爭能力等[11]。本研究中，紫花針茅接種內(nèi)生枯草芽孢桿菌265ZY4后株高和葉寬比對照分別增加35.02%和34.69%，這可能與該菌株在離體條件下具有溶磷、產(chǎn)IAA和抑菌等生物學(xué)功能[7]有關(guān);該結(jié)果也與Narendra等[12]報道的番茄(Lycopersicon esculentum)內(nèi)生細菌研究結(jié)果相一致。在低溫脅迫下，植物葉片的葉綠素降解是一個普遍現(xiàn)象[13]，而干旱抑制葉綠素生物合成酶的活性從而阻礙葉綠素的合成[14]，紫外線破壞植物葉綠體前體的形成和葉綠體整體結(jié)構(gòu)，降低葉綠素含量[15];本試驗結(jié)果表明，在低溫和高溫脅迫下帶菌紫花針茅葉綠素含量先上升后下降，而對照呈持續(xù)下降趨勢，紫外線脅迫下帶菌和對照均呈下降趨勢，但接種內(nèi)生細菌的紫花針茅葉綠素含量高于對照，下降率低于對照，表明高、低溫和紫外線脅迫對紫花針茅葉綠素含量有明顯的破壞作用，但內(nèi)生細菌可能通過代謝產(chǎn)物保護宿主葉綠素或促進了宿主葉綠素的合成，進而使帶菌植株葉綠素含量高于對照，提高了抗逆能力，具體是何機制還需進一步研究。

可溶性蛋白和可溶性糖作為植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物抗逆性中起到調(diào)節(jié)作用[16]。本試驗中，可溶性蛋白和可溶性糖隨著脅迫時間呈先上升再下降的趨勢，與孫富等[17]和楊盛等[18]的報道一致，但楊玉珍等[19]報道，低溫脅迫下香椿(Toona sinensis)可溶性蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)“升高-降低-再升高”趨勢，本試驗中可能在于脅迫時間不夠長未能觀察到蛋白含量上升的趨勢;在溫度脅迫下帶菌紫花針茅可溶性糖含量在第4天后顯著高于對照，特別是在紫外線脅迫下第6天后顯著高于對照，說明內(nèi)生細菌處理提高了宿主體內(nèi)的可溶性糖含量，但在逆境脅迫下可溶性蛋白含量與對照差異不明顯，說明內(nèi)生細菌在溫度脅迫中期和紫外線脅迫后期保持了可溶性糖的含量，提高了細胞的滲透壓，從而緩解逆境條件對植物的傷害，起到增強紫花針茅抗逆性的作用。低溫下可溶性糖較高溫下穩(wěn)定，且紫外線脅迫下最高峰出現(xiàn)較晚，這可能與宿主本身為高寒草地牧草，對低溫和紫外線脅迫本身有較高耐性有關(guān)，但具體機制需進一步研究。

SOD等抗氧化酶可以清除逆境脅迫下植物細胞內(nèi)積累的活性氧，減緩細胞膜脂質(zhì)的過氧化[20]。本試驗中，紫花針茅SOD活性隨著脅迫時間的延長，呈降低-升高-降低的規(guī)律，但波動不大，表明溫度和紫外線脅迫對紫花針茅SOD活性的影響小;接種內(nèi)生細菌265ZY4的紫花針茅在溫度脅迫下SOD活性始終高于對照，但紫外光脅迫下SOD活性初期下降明顯，顯著低于對照，后上升，第8天時顯著高于對照，表明內(nèi)生細菌可以提高宿主SOD活性，提高其抗逆能力。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是類黃酮合成代謝與苯丙烷類代謝途徑過程中的限速酶和關(guān)鍵酶，類黃酮在減輕和消除由干旱、紫外線等脅迫引起的活性氧傷害方面，發(fā)揮直接或間接的作用[21]。本試驗結(jié)果表明紫花針茅PAL活性隨著低溫脅迫時間的延長呈先上升再下降的趨勢，這與陳雷等[22]研究結(jié)果一致，但在高溫和紫外線脅迫下呈下降-上升-下降的規(guī)律，低溫脅迫第4天達最大值，高溫和紫外線脅迫第6天時PAL活性達到最高;在低溫和紫外線脅迫下接種內(nèi)生細菌的紫花針茅PAL活性高于對照，且在低溫脅迫后期PAL活性下降的速度比對照減小1.3倍;該結(jié)果表明內(nèi)生細菌可有效地保持或提高PAL活性，增加次生化合物類黃酮等的合成，增強宿主對逆境脅迫的忍耐力。

從各種生化指標(biāo)看，第2天時除可溶性蛋白質(zhì)在高溫脅迫、SOD在低溫脅迫及PAL在紫外線脅迫外，對照與處理一致或高于處理，第2天之后帶菌紫花針茅生化指標(biāo)上升，第8天時帶菌處理變化率除SOD紫外線脅迫外均大幅下降，且葉綠素和可溶性蛋白變化率與對照基本一致。該結(jié)果說明帶菌紫花針茅生化指標(biāo)對外界環(huán)境的變化反應(yīng)滯后，且隨脅迫時間增長生化指標(biāo)上升，但較長時間脅迫后與對照沒有區(qū)別，即內(nèi)生細菌通過自身基因或影響植物體內(nèi)酶活性[23]可以提高宿主的抗逆能力，但這種保護作用有一定限度。