鐘 姍，王 筠，劉乃嘉，顏鴻飛，李延鵬，張慶英，盛司潼

1)深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東深圳518055；2)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，廣東汕頭515041；3)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，廣東汕頭515000

食管癌是當(dāng)今最常見的惡性消化道腫瘤之一，依病理分型，主要分為食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)和食管腺癌兩大類[1]．全球范圍內(nèi)的食管癌約90%是ESCC，中國亦是如此[1-2]．盡管食管癌的診斷和治療手段目前已有很大改進(jìn)，但是多數(shù)患者仍是在中晚期才被發(fā)現(xiàn)，通常已伴有癌癥的局部侵襲和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移．因而，食管癌患者的5年生存率僅為15%～25%[3]．于是，通過尋找新的生物標(biāo)記物，提高早期診斷的精準(zhǔn)率，揭示及干預(yù)疾病分子調(diào)控機(jī)制，是降低食管癌死亡率的有效途徑．

microRNA(miRNA)是一類全長約18～24個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，主要通過與下游信使RNA(mRNA)3′非編碼區(qū)(3′UTR)互補結(jié)合，導(dǎo)致直接抑制蛋白質(zhì)翻譯或轉(zhuǎn)錄本的降解，以調(diào)整下游基因的表達(dá)．越來越多的證據(jù)支持miRNAs是腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是人類癌癥中有用的診斷和預(yù)后標(biāo)志物[4-7]．本研究前期運用miRNA芯片(上?？党缮锕こ逃邢薰旧a(chǎn))，從食管鱗癌組織與癌旁正常組織比較的差異表達(dá)譜中，篩選出miR-3914、miR-8082和miR-4770三個有顯著性差異表達(dá)的miRNAs，結(jié)果提示，它們可能與ESCC病變的發(fā)生發(fā)展相關(guān)．但是，目前尚無關(guān)于miR-3914、miR-8082和miR-4770在腫瘤研究領(lǐng)域的報道．本研究旨在擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步檢測并分析miR-3914、miR-8082和miR-4770在ESCC中的表達(dá)變化，通過生物信息學(xué)方法預(yù)測它們潛在的分子調(diào)控功能．

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 組織標(biāo)本和細(xì)胞

實驗所用的40對食管鱗癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本均采集自汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，并已獲得汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的許可和患者本人或家屬的知情同意．

外科手術(shù)切除的新鮮組織，由有經(jīng)驗的病理醫(yī)生分離，然后迅速置于RNAwait保護(hù)液中，-20 ℃過夜，再置于-80 ℃長期保存待用．實驗所用食管正常上皮細(xì)胞Het-1A源自ATCC，ESCC細(xì)胞系KYSE180和KYSE150均系汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院許麗艷教授惠贈．

1.1.2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素和胰酶均購自美國Hyclone公司．胎牛血清和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司．miRNA mimic、miRNA NC及其引物均購自上海生工生物工程有限公司．AllPrep DNA/RNA Mini Kit試劑盒購自德國 Qiagen公司．Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ定量試劑均購自日本Takara公司．p53、c-Myc、Bcl-2和GAPDH抗體均購自美國CST公司．二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司．

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

Het-1A、KYSE180和KYSE150細(xì)胞系均使用包含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和100 units/mL (約60 μg/mL, 1 mg=1 670 units)青霉素與100 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．

1.2.2 實時定量熒光PCR(qRT-PCR)

使用AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen)提取總RNA；使用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書設(shè)計qRT-PCR特異性5’-引物序列，如表1，使用SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ Kit進(jìn)行qRT-PCR分析；以U6(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供)為內(nèi)參計算miRNA相對表達(dá)量．

表1 qRT-PCR檢測miRNAs所需特異性5’-引物序列Table 1 5’-primer sequences for miRNAs detection by qRT-PCR

1.2.3 生物信息學(xué)分析

利用TargetScan(http://www.targetscan.org/)和RNA22(http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html)數(shù)據(jù)庫，預(yù)測差異表達(dá)miRNA的靶基因.利用DAVID 6.8(http://david.ncifcrf.gov)對差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析和Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG)信號通路富集分析，再利用Cytoscape軟件建立基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)．

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將2×105個KYSE180細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞鋪滿70%～90%時，按照lipofectamine 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染．48 h后提取細(xì)胞的總蛋白質(zhì)．

1.2.5 蛋白免疫印跡

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞總蛋白質(zhì)置于體積分?jǐn)?shù)為10% 的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上．用體積分?jǐn)?shù)為5%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)于室溫封閉1.5 h，一抗孵育，4 ℃過夜．用含體積分?jǐn)?shù)為0.1%吐溫的Tris-Hcl緩沖溶液(Tris buffered saline Tween, TBST)洗膜，二抗室溫封閉1 h，再使用ECL(electrochemiluminescence)化學(xué)發(fā)光底物使印跡條帶可視化，并采用Tanon化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)進(jìn)行成像分析．

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

運用GraphPad Prism 6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示．顯著性差異檢驗分別采用兩組間比較的Student’st-test檢驗和多組間比較的One-way ANOVA檢驗．設(shè)定P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異．

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-3914和miR-8082在ESCC組織中表達(dá)下調(diào)

運用qRT-PCR法對40對ESCC組織和匹配的癌旁組織進(jìn)行相對表達(dá)量分析，結(jié)果如圖1．由圖1(a)和(b)可見，與癌旁正常組織相比，miR-3914和miR-8082在ESCC組織中的表達(dá)呈顯著下調(diào)(P<0.05)．由圖1(c)可見，miR-4770的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)顯著性差異．由圖1(d)可見，以配對的正常食管癌旁組織為參照1.000，miR-3914、miR-8082和mirR-4770的倍數(shù)變化分別為0.492、0.665和0.895，如圖1(d)．

圖1 miR-3914和miR-8082在ESCC組織和配對癌旁正常組織中的表達(dá)Fig.1 Expressions of miR-3914 and miR-8082 in ESCC tissues and matched adjacent normal tissues

2.2 miR-3914和miR-8082在ESCC細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)

通過對ESCC細(xì)胞系的表達(dá)檢測結(jié)果(圖2)分析發(fā)現(xiàn)，與正常食管上皮細(xì)胞Het-1A比較，miR-3914和miR-8082在ESCC細(xì)胞中的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)． 其中，以Het-1A細(xì)胞表達(dá)量為參照1.000，miR-3914在ESCC細(xì)胞KYSE180和KYSE150中的表達(dá)量分別為0.213和0.538；而miR-8082在ESCC細(xì)胞KYSE180和KYSE150中的相對表達(dá)量分別為0.491和0.345．

圖2 miR-3914和miR-8082在ESCC細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.2 Expressions of miR-3914 and miR-8082 in ESCC cell lines

2.3 miR-3914和miR-8082下游靶基因的GO分析

利用TargetScan和RNA22數(shù)據(jù)庫，預(yù)測miR-3914和miR-8082的下游靶基因．通過對兩個數(shù)據(jù)庫的交集分析，發(fā)現(xiàn)miR-3914有434個下游靶基因，而miR-8082有1 740個．從生物過程和分子功能方面對兩個miRNAs的靶基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)miR-3914和miR-8082均參與RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄、蛋白結(jié)合和細(xì)胞凋亡等過程(分析結(jié)果請掃描論文末頁右下角二維碼).

2.4 miR-3914和miR-8082下游靶基因的KEGG分析

將miR-3914和miR-8082的下游靶基因進(jìn)行KEGG通路分析，結(jié)果見表2．由表2可見，miR-3914靶基因主要富集在癌癥相關(guān)信號通路、泛醌和其他萜醌生物合成信號通路、腎細(xì)胞癌信號通路、黏著斑信號通路和阿米巴病信號通路；miR-8082靶基因主要富集在神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、胰腺癌信號通路、破骨細(xì)胞分化信號通路、甲狀腺激素信號通路、ErbB信號通路、黑色素瘤信號通路及癌癥相關(guān)信號通路等．其中，miR-3914和miR-8082下游靶基因均呈與癌癥相關(guān)信號通路相關(guān)，P<0.05．

圖3是miR-3914和miR-8082對癌癥相關(guān)通路富集的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖．由圖3可見，miR-3914和miR-8082在癌癥相關(guān)通路調(diào)控的基因數(shù)分別為17個和52個，且兩個miRNA均可調(diào)控LAMC2、CCDC6和PDGFB基因．

表2 miR-3914和miR-8082下游靶基因的KEGG分析Table 2 KEGG pathway analysis of miR-3914 and miR-8082 targeted genes

圖3 miR-3914和miR-8082對癌癥相關(guān)通路富集的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network map of miR-3914 and miR-8082 enriched genes from pathways in cancer

圖4 miR-3914和miR-8082對與癌癥發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)影響Fig.4 Effects of miR-3914 and miR-8082 on expression of ESCC-related key proteins

2.5 miR-3914和miR-8082調(diào)控癌癥發(fā)病相關(guān)蛋白的表達(dá)

運用miR-3914 mimic和miR-8082 mimic轉(zhuǎn)染ESCC的KESE180細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)后檢測與癌癥病變相關(guān)的關(guān)鍵蛋白p53、c-Myc和Bcl-2的表達(dá)，結(jié)果如圖4．由圖4可見，與未轉(zhuǎn)染同株細(xì)胞相比，miR-3914 mimic和miR-8082 mimic轉(zhuǎn)染后細(xì)胞p53蛋白質(zhì)的表達(dá)均增加，同時c-Myc和Bcl-2蛋白質(zhì)的表達(dá)均降低．

3 討 論

通過與mRNA 3′UTR互補結(jié)合，miRNAs可以同時與幾個或數(shù)百個基因相互作用，并調(diào)節(jié)機(jī)體發(fā)育、生理和病理過程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、先天性或適應(yīng)性免疫反應(yīng)等[8]．目前，人類基因組包含至少1 500個帶注釋的miRNA基因[9]，其在腫瘤中的異常表達(dá)對多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要影響[10-12]．多項研究表明，miRNAs與ESCC的腫瘤轉(zhuǎn)移和患者存活率相關(guān)．例如，miR-874-3p在ESCC中是低表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和總存活率關(guān)聯(lián)，可作為ESCC患者的獨立預(yù)后因素．體外實驗miR-874-3p的過表達(dá)可顯著抑制ESCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[13]．miR-92b-3p可通過靶向ITGAV抑制ESCC的侵襲和轉(zhuǎn)移，且有良好的預(yù)后作用[14]．miRNA-508通過連續(xù)激活PI3K/Akt信號通路可促進(jìn)腫瘤的侵襲表型，并與ESCC患者的不良生存密切相關(guān)[15]．本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，miR-3914和miR-8082在ESCC組織中的表達(dá)呈顯著降低，而miR-4770的表達(dá)則無明顯差異.由此提示，miR-3914和miR-8082很可能參與ESCC發(fā)生和發(fā)展的分子調(diào)控機(jī)制．另外，與正常食管上皮細(xì)胞比較，miR-3914和miR-8082在ESCC細(xì)胞系KYSE150和KYSE180中的表達(dá)均呈顯著性降低，進(jìn)一步證明了miR-3914和miR-8082與ESCC的病變有密切關(guān)系．

利用生物信息學(xué)技術(shù)，通過對Targetscan和RNA22數(shù)據(jù)庫的預(yù)測整合分析，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-3914具有434個靶基因和miR-8082具有1 740個靶基因．進(jìn)一步的GO分析發(fā)現(xiàn)，miR-3914和miR-8082可參與RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄、蛋白結(jié)合和細(xì)胞凋亡等過程．KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，miR-3914和miR-8082均與癌癥相關(guān)的信號通路相關(guān)聯(lián)，可參與調(diào)控LAMC2、CCDC6、PDGFB基因．研究表明，LAMC2、CCDC6和PDGFB基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及診斷預(yù)后密切相關(guān)：LAMC2過表達(dá)可預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[16]，且在中國高危食管鱗癌患者中LAMC2 mRNA及蛋白過表達(dá)，其蛋白表達(dá)模式在ESCC患者預(yù)后中起重要作用[17]．CCDC6在DNA損傷調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用，其缺失或失活可通過抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)腫瘤惡化，是一種有潛力的候選生物標(biāo)志物[18]．另有研究表明，PDGFB的mRNA表達(dá)水平在淋巴樣母細(xì)胞和腫瘤組織中均降低，其基因變異可能對胰腺癌的易感性有影響[19]．因此，深入調(diào)研miR-3914和miR-8082調(diào)控腫瘤相關(guān)基因LAMC2、CCDC6和PDGFB的作用機(jī)制，對食管鱗癌精準(zhǔn)診療可提供新的理論依據(jù)和技術(shù)手段．

癌癥相關(guān)信號通路涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及血管生成等多個細(xì)胞生物學(xué)過程．p53、c-Myc和Bcl-2蛋白質(zhì)作為信號通路中的關(guān)鍵因子，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用．原癌基因c-Myc是一種可調(diào)節(jié)且可易位的基因，誘導(dǎo)c-Myc的表達(dá)下調(diào)，可停滯細(xì)胞周期的G0/G1期，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡的調(diào)控[20-21]．現(xiàn)已公認(rèn)p53作為一種重要的腫瘤抑制基因，在腫瘤的發(fā)生中具有雙刃劍的特性. CHAVA等[22]研究結(jié)果顯示，抑癌基因p53可作為食管癌發(fā)生發(fā)展的預(yù)后標(biāo)志物．Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡過程中同樣發(fā)揮至關(guān)重要的作用．當(dāng)腫瘤發(fā)生時，存在著Bcl-2的表達(dá)上調(diào)和Bax的表達(dá)下調(diào)，而減小Bcl-2/Bax的比值，會有利于抑制腫瘤的發(fā)展進(jìn)程[23]．并且，許多研究表明，miRNA可通過調(diào)控下游p53、c-Myc和Bcl-2蛋白質(zhì)的表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等過程[24-26]．本研究也通過在ESCC的細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-3914 mimic和miR-8082 mimic的體外實驗發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比，p53蛋白質(zhì)表達(dá)增加，c-Myc和Bcl-2蛋白質(zhì)表達(dá)降低. 此結(jié)果與已報道的在其他腫瘤上的發(fā)現(xiàn)[24-26]相吻合，進(jìn)而證明了miR-3914和miR-8082 與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)．

結(jié) 語

本研究通過檢測食管鱗癌組織和細(xì)胞中miR-3914和miR-8082的表達(dá)，并利用生物信學(xué)方法對其下游靶基因進(jìn)行相關(guān)分子生物學(xué)功能的預(yù)測，結(jié)果表明，兩者在食管鱗癌中的異常表達(dá)與該病的病變密切相關(guān)，均具有成為食管鱗癌診斷治療新生物標(biāo)記物的潛能，因而可繼續(xù)深入研究，以揭示它們在該病的分子調(diào)控機(jī)制．本研究為食管鱗癌的分子診斷與治療新方案提供了實驗依據(jù)．