趙天霞 沈 飛 周曰春 劉 瀟 方 勇 李 彭 裴 斐 邢常瑞

(南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心1，南京 210023)(南京靈山糧食儲備庫有限公司2, 南京 211599)

小麥是我國的主要糧食品種之一，但也是最易被霉菌污染的食品原料之一。小麥中富含的營養(yǎng)物質是微生物生長的良好培養(yǎng)基，當環(huán)境條件適宜時，微生物就會繁殖，造成小麥霉爛變質[1]。霉菌滋生不僅消耗谷物中的營養(yǎng)物質，使谷物品質降低，還會產(chǎn)生真菌毒素，對人畜健康造成了嚴重威脅[2]。因此，小麥霉變狀況的檢測分析具有重要意義[3]。從目前來看，常用的小麥霉變檢測方法包括平板計數(shù)法[4]、酶聯(lián)免疫法[5]、熒光染色法[6]等，雖然這些方法的檢測精度普遍較高，但均存在過程繁瑣、時效性差等不足，不能滿足現(xiàn)場實時檢測的需求，存在很大局限性[7]。因此，急需發(fā)展一種快捷方便的檢測技術來解決小麥霉變的檢測難題。

近年來，基于氣敏傳感器陣列和模式識別的電子鼻技術已在環(huán)境檢測[8]、食品[9-10]、化工[11]、醫(yī)藥[12]等領域得到了廣泛應用。電子鼻由非特定的化學檢測器組成，它們與不同的揮發(fā)性分子相互作用并提供電子信號，可以有效地用作與產(chǎn)品相關的揮發(fā)性分子的指示，并通過模式識別系統(tǒng)識別和量化氣味，在谷物霉變快速檢測中具有巨大的應用潛力[13]。崔麗靜等[14]采用電子鼻技術對40個正常玉米樣品和41個霉變樣品建立了識別模型，并通過優(yōu)化10個傳感器組合，提高了樣品的霉變判別率。Eifler等[15]利用電子鼻差異檢測小麥籽粒中的鐮刀菌，結果顯示，電子鼻能較好地區(qū)分感染鐮刀菌和未感染的小麥谷粒，且準確度高于80%。Campagnoli等[16]通過研究驗證了電子鼻可以區(qū)分已被黃曲霉毒素污染的樣品和未被污染的樣品，且電子鼻能夠通過直接檢測毒素和基于檢測與黃曲霉毒素相關的揮發(fā)性真菌代謝物的間接識別來檢測污染。沈飛[17]等對谷物中常見霉菌的特征揮發(fā)性氣味物質進行了檢測分析。結果顯示，線性判別分析(LDA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)模型對谷物中黃曲霉類、寄生曲霉類和青霉類樣品的整體判別正確率分別達到100%和97.4%。

目前，小麥有害霉菌侵染及霉變程度的快速檢測仍是一大難點。前人利用電子鼻等技術進行霉變小麥定性判別已證明其可行性，但研究仍有待深入，未實現(xiàn)霉變程度的定性定量同步分析。因此，本研究擬以受不同有害霉菌侵染的小麥籽粒為對象，獲取不同儲藏階段(0、1、3、5和7 d)小麥揮發(fā)性氣味的電子鼻響應信號，結合多元統(tǒng)計分析方法建立小麥霉菌侵染程度的定性與定量同步分析方法，為利用電子鼻技術實現(xiàn)谷物品質快速分析提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥樣品(徐麥33，水分含量16.0%)。除雜并篩選籽粒飽滿、無異味的樣品，經(jīng)Co-60輻照(劑量：12 kGy)滅菌后裝入無菌塑料密封袋，4 ℃冷藏，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 霉菌培養(yǎng)與接種

5種小麥等谷物中常見有害霉菌標準菌株：串珠鐮刀菌(F.moniliforme)83227、層出鐮刀菌(F. proliferatum)195647、雪腐鐮刀菌(F.nivale)3.503、寄生曲霉(A.parasiticus)3.3950和赭曲霉(A.ochraceus)3.3486。

在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基上分別接種5種不同的霉菌菌株，放置于28 ℃和相對濕度85%的培養(yǎng)箱內(nèi)進行活化培養(yǎng)。待霉菌生長到第15天后產(chǎn)生大量孢子，用無菌水沖洗培養(yǎng)基表面產(chǎn)生的菌絲，并將孢子懸浮液收集于50 mL錐形瓶中，依據(jù)國標GB/T 4789.2—2016平板計數(shù)法分別統(tǒng)計5種霉菌孢子懸浮液的濃度，并用去離子水調至約1×105CFU/mL，4 ℃冷藏，備用。

將小麥樣品分為150份，每份150 g，隨機分成5組，每組30份樣品。分別接種1 mL孢子懸浮液和4 mL無菌水于小麥樣品表面，每種懸浮液接種30份，隨后分別放于150個上方有開孔的的滅菌塑料盒(規(guī)格：115 mm×115 mm×65 mm)中。隨后轉移至28 ℃、85% RH的人工氣候箱中儲藏7 d。

樣品從接種霉菌起，選取時間節(jié)點0、1、3、5、7 d，隨機選取受5 種不同霉菌感染的小麥樣品各6 份，樣品放入密封袋中于4 ℃冷藏備用。在檢測前將冷藏的樣品取出，在室溫下放置約2 h直至樣品溫度趨于室溫，隨后稱取5 g小麥樣品置于20 mL 頂空瓶中，待頂空瓶中空氣抽出即可進行電子鼻檢測。

1.3 儀器設備

Fox 3000型電子鼻(法國Alpha MOS公司)由頂空全自動進樣器、12 個金屬氧化物傳感器和AlphaSoft 軟件操作系統(tǒng)組成。檢測參數(shù)如下：樣品采集時間60 s，采樣頻率1 次/s，載氣流速150 mL/min，保溫室溫度60 ℃，采樣速度1 mL/s，震蕩速度500 r/min，保溫時間120 s。樣品進行4次重復測定，取平均值進行分析。測定時，采用金屬氧化物傳感器矩陣作為檢測系統(tǒng)，該傳感器由對氣體敏感的半導體材料構成，當揮發(fā)性物質接觸到傳感器時，電阻值會發(fā)生相應的變化，記錄下電阻值的變化，并依據(jù)氣味標識和計量學軟件對不同氣味進行識別[18]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運用MATLAB v8.4軟件對獲取的小麥電子鼻響應信號進行處理和模型建立。為消除噪音及信號漂移等不良影響，采用標準化(Autoscale)、標準正態(tài)變換(standard normal variate，SNV)等方法對傳感器響應信號進行預處理。隨后，運用主成分分析(principal component analysis，PCA)、線性判別分析(liner discriminant analysis，LDA)對不同霉變程度的小麥樣品進行區(qū)分和判別；運用偏最小二乘回歸分析(partial least squares regression，PLSR)對小麥樣品菌落總數(shù)水平進行定量預測，其評估指標包括模型決定系數(shù)(correlation coefficient of determination,R2)、建模和預測均方根誤差(root mean squared error of calibration and prediction, RMSEC/RMSEP)、交互驗證均方根誤差(root mean squared error of cross validation, RMSECV)以及相對分析偏差(residual predictive deviation, RPD)等。

2 結果與分析

2.1 樣品菌落總數(shù)分析

圖1為儲藏期間小麥樣品菌落總數(shù)的變化趨勢圖。根據(jù)相關文獻，依據(jù)菌落總數(shù)可將小麥樣品分為未霉變[<2.7 log(CFU/g)]、開始霉變[2.7～4 log(CFU/g)]和嚴重霉變[>4 log(CFU/g)]3個階段。由圖1可知，除層出鐮刀菌組外，其余四組染菌樣品在0～1 d時菌落總數(shù)均低于2.5 log(CFU/g)，處于未霉變狀態(tài)，原因是在初期，樣品剛感染霉菌，霉菌均覆蓋于樣品表面，未引起樣品內(nèi)部結構的變化，因此將0～1 d判為未霉變階段。當儲存至3 d時，所有樣品的菌落數(shù)均在2.7～4 log(CFU/g)間，此時，霉菌已開始進入樣品內(nèi)部并引起內(nèi)部結構的改變，將此階段劃分為開始霉變階段。隨著儲藏時間達5～7 d，霉菌快速增長，霉變程度也不斷加深，樣品基本已達到嚴重霉變狀態(tài)。其中，層出鐮刀菌組可能由于活性較強，繁殖能力最大，因此菌落總數(shù)最多。從整體變化趨勢來看，盡管不同霉菌的繁殖能力有差異，但菌落總數(shù)呈現(xiàn)顯著的上升趨勢，表明隨著時間的延長，霉菌在樣品中不斷繁殖，同時產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，導致小麥揮發(fā)性成分不斷變化。

圖1 不同儲藏階段小麥菌落總數(shù)變化趨勢圖

2.2 小麥樣品電子鼻信號響應分析

圖2為受不同霉菌侵染的小麥樣品及受層出鐮刀菌195647侵染的樣品在不同儲藏階段的電子鼻信號雷達圖。由圖2a可知，除了傳感器LY2/LG、LY2/gCT以及PA/2響應信號較低外，剩余傳感器對于小麥產(chǎn)生的揮發(fā)性物質更為敏感。從雷達圖的變化趨勢和形狀來看，受不同霉菌侵染的小麥樣品的變化趨勢大體相似，說明不同霉菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質有相似之處，但也存在一定差異。小麥霉變后會產(chǎn)生較多的胺類化合物、碳氫化合物以及芳香族化合物等，使得部分傳感器響應值發(fā)生顯著變化，而烷烴類、硫化氫和氮氧化合物等成分較少，導致其響應值變化不大[19]。結果表明，受不同霉菌侵染的小麥產(chǎn)生的揮發(fā)性物質之間存在差異，電子鼻的12 個傳感器對不同的氣味的敏感度不同，因此，可應用電子鼻對受不同霉菌侵染的小麥進行區(qū)分。

圖2 小麥樣品電子鼻響應信號雷達圖

由圖2b可知，隨著儲藏時間的增加，不同傳感器也呈現(xiàn)出不一致的變化趨勢。然而，由于揮發(fā)性物質的組成十分復雜，而電子鼻傳感器的非特異性屬性，因此，不同傳感器隨儲藏時間的變化規(guī)律并不十分顯著。隨著小麥霉變程度的加深，PA/2、T30/1等代表碳水化合物、芳香族化合物、氮化合物類的物質響應信號存在減弱趨勢，而代表醇、酮類物質的LY2/G、LY2/AA的響應信號逐漸增強。結果表明有害霉菌在生長代謝過程中會消耗小麥中的碳水化合物、蛋白質和酯類等有機物，生成醇酮等次級產(chǎn)物。這些物質在霉菌的代謝過程中產(chǎn)生，使得電子鼻響應值發(fā)生不斷變化[20]。

2.3 PCA結果分析

依據(jù)菌落總數(shù)，將所有樣品劃分為未霉變、開始霉變和嚴重霉變?nèi)?。主成分分析結果如圖3所示，其中第一主成分的貢獻率為92.07%，第三主成分的貢獻率為1.99%，全部貢獻率達94.06%，代表了原始變量的大部分信息。由圖可知，不同程度的霉變樣品存在一定的聚類趨勢。未霉變樣品點分布與霉變樣品分布存在較大差異，原因可能在于小麥在霉變過程中產(chǎn)生了特殊的揮發(fā)性物質，導致其電子鼻的響應信號出現(xiàn)系統(tǒng)差異。然而，由于不同霉菌侵染樣品產(chǎn)生的氣味影響可能互相混淆，開始霉變和嚴重霉變的小麥樣品存在部分重疊，但仍有一定的分離趨勢，表明隨著霉變程度的加深，樣品內(nèi)部的營養(yǎng)物質被快速分解并產(chǎn)生大量揮發(fā)性物質，造成其電子鼻信號發(fā)生相應改變。結果表明，不同霉變程度的小麥樣品的電子鼻信號存在差異，為進一步的判別分析奠定了基礎。

圖3 受不同霉菌侵染的小麥樣品電子鼻主成分分析圖

2.4 LDA結果分析

利用用LDA法將所有樣品依據(jù)其菌落總數(shù)分為未霉變、開始霉變和嚴重霉變?nèi)悺１?為LDA模型判別結果。由表1可知，LDA 模型可較好區(qū)分受單一優(yōu)勢霉菌侵染的樣品，建模集準確率均為 100%，驗證集中僅串珠鐮刀菌83227和層出鐮刀菌3.507組中分別有1個樣品被誤判，剩余組樣品均能被成功區(qū)分。當將受不同霉菌侵染的樣品綜合在一起建立模型時，其判別正確率有所降低，驗證集為84.0%。另外，從假陰性和假陽性指標可知，未被區(qū)分的樣品基本都是被錯判的樣品，即霉變樣品多數(shù)錯判為未霉變樣品。可能原因在于不同霉菌產(chǎn)生的揮發(fā)性成分十分復雜，可能存在相互干擾；另一方面，處于閾值附近的小麥樣品也容易發(fā)生誤判，導致正確率降低。為進一步提高模型精度，可在下一步研究中，延長儲藏時間并調整霉菌濃度與霉菌侵染時間，補充自然霉變的樣品，以不斷提高模型的實用性和穩(wěn)健性。

總體可知，雖然LDA模型的判別精度有待進一步提升，但不同霉變程度的小麥樣品仍能得到較好的區(qū)分，表明儲藏時間的增加，小麥的霉變程度也在增加，樣品中的脂肪、蛋白質等營養(yǎng)物質被快速分解，產(chǎn)生大量的毒素和揮發(fā)性物質， 導致電子鼻響應信號與儲藏前期產(chǎn)生了較大的差異，為電子鼻氣體傳感器提供了判別基礎。

表1 受霉菌侵染的樣品不同霉變程度下的LDA模型判別結果

2.5 PLSR結果分析

小麥樣品中的菌落總數(shù)的PLSR建模結果如表2所示。由表可知，對于感染單一霉菌的樣品，建模集的決定系數(shù)Rc2均在 0.85以上，建模均方根誤差(RMSEC)低于 0.40 log CFU/g。其中雪腐鐮刀菌 3.3950 組的模型結果最優(yōu)，Rc2值達到 0.984， RMSEP和RPD 值分別為 0.223 log CFU/g和5.51。驗證集中，對單一霉菌進行預測時，Rp2值都超過0.80，RMSEP值在0.500 log CFU/g左右。除層出鐮刀菌3.503組外，其余4 組模型的RPD值均在2.50以上，說明模型相關性較好，穩(wěn)健性較高。而層出鐮刀菌3.503組的RPD值也達到2.21，說明該模型具有定量分析潛力。將全部樣品進行綜合建模時，精度略有降低，Rp2值和RMSEP值分別為 0.852和0.504 log CFU/g，RMSEP值偏大，導致RPD值降低，介于2～2.5之間，低于單一霉菌侵染組模型。但結果顯示所有模型的 RPD 值均高于2.0，有用于定量分析的可能。圖4為小麥菌落總數(shù)與電子鼻響應值相關關系圖，樣品均分布于中心線兩側，表明兩者具有較高相關性。結果表明，通過電子鼻技術在預測小麥中的菌落總數(shù)含量，判斷小麥是否發(fā)生霉變方面具有可行性。但由于樣品數(shù)量、電子鼻傳感器性能及數(shù)量等的影響，模型的整體預測精度仍有待提升。

表2 受不同霉菌侵染的小麥菌落總數(shù)預測模型分析結果

圖4 小麥樣品中菌落總數(shù)與電子鼻響應值相關關系

3 結論

本研究通過電子鼻對受不同霉菌侵染的小麥樣品在不同儲藏階段的揮發(fā)性氣體成分的檢測以及多元統(tǒng)計分析技術，建立了電子鼻響應信號與霉菌侵染程度的定性定量分析模型。PCA結果顯示，樣品在不同霉變程度下的氣味信息變化存在一定的規(guī)律，不同霉變狀態(tài)的樣品可得到較好區(qū)分；運用LDA方法對受單一霉菌侵染的小麥樣品的判別率均在90%以上，對全部樣品的判別率超過80%；運用PLSR建立樣品菌落總數(shù)的回歸模型，全部樣品的Rp2值和RMSEP值分別為 0.852和0.504log (CFU/g)，RPD值為2.30，表明建立的模型可用于定量分析且模型精度較高。綜上可知，作為一種快速、便捷的氣味檢測手段，電子鼻傳感技術在小麥樣品霉變狀態(tài)的區(qū)分及霉變程度的快速識別方法具有一定可行性，為糧食霉變早期檢測及質量評估提供了技術參考。