謝 剛 李 麗 黎 睿 王松雪 王 碩

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院1，天津 300457)(國家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院2，北京 100037)

赭曲霉毒素主要是由曲霉屬和青霉屬產(chǎn)生的一類有毒的次生代謝物，其中赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)毒性最強(qiáng)，能產(chǎn)生如胚胎毒性、致畸性、致癌性、免疫毒性、肝毒性等嚴(yán)重的毒性，被世界衛(wèi)生組織的國際癌癥研究組織列為2B級(jí)疑致癌物質(zhì)[1]。此外，OTA穩(wěn)定存在于谷物、酒類、干果、堅(jiān)果、咖啡和豆類等農(nóng)作物及其制品中[2-3]。目前， GB 2761—2017中規(guī)定谷物及其制品中赭曲霉毒素A限量為5.0 μg/kg[4]。

常用的 OTA 檢測方法主要有膠體金試紙條法[5-7]、酶聯(lián)免疫法或免疫傳感器[8]、生物傳感器法[9]、間接競爭免疫分辨熒光免疫分析[10]、液相色譜法或液質(zhì)聯(lián)用法[11-15]等方法。薄層色譜法由于操作復(fù)雜，目前應(yīng)用較少。膠體金和酶聯(lián)免疫方法用于快速篩查。液質(zhì)聯(lián)用儀檢測需要高端的質(zhì)譜儀。離線凈化的普通高效液相色譜方法目前應(yīng)用較多，但存在凈化過程操作繁瑣、分析速度較慢等問題。早在1991年，就有報(bào)道使用離線自動(dòng)固相萃取高效液相色譜法測定里谷物及其制品中黃曲霉毒素和赭曲霉毒素A的方法[16-17]。目前在日常液相檢測中也常使用免疫親和柱離線凈化裝置凈化，這些離線自動(dòng)凈化方法提高了檢測結(jié)果的可比性、節(jié)省了時(shí)間和人力成本，但樣品前處理步驟較為繁瑣，免疫親和柱只能使用1次，離線凈化檢測耗材成本仍然較高，檢測效率仍然較低[18]。2012年，研究人員嘗試通過特殊處理的免疫親和預(yù)柱(2.1 mm ID×50 mm)在線凈化-柱后溴衍生-高效液相色譜法對(duì)花生、無花果干、紅辣椒粉等樣品中4種黃曲霉毒素檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證[19-21]，發(fā)現(xiàn)在線自動(dòng)化凈化樣品顯著提高了分析效率和重現(xiàn)性，降低了檢測成本。

本研究采用全自動(dòng)在線凈化技術(shù)，使用將抗體耦合到耐壓聚合物的免疫親和柱(1 mm ID×10 mm)，結(jié)合RIDA?CREST ICE在線固相萃取裝置，建立了在線凈化液相色譜檢測玉米、小麥中赭曲霉毒素A的方法，增加了免疫親和柱的使用次數(shù)，提高了檢測的自動(dòng)化水平和檢測效率，降低了檢測成本，以滿足大規(guī)模樣品準(zhǔn)確定量的需求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Spark通用全自動(dòng)高效液相色譜，配RIDA?CREST 在線固相萃取系統(tǒng)、熒光檢測器；OtaTest在線固相萃取柱；Pulverisette14 高速旋轉(zhuǎn)粉碎機(jī)；SIGMA3-30K離心機(jī)；VX-Ⅲ振蕩器。

赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液；甲醇、乙腈：色譜純；Milli-Q超純水；四鵬酸鈉(硼砂)、曲拉通X-100(Triton X-100)、吐溫-20、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸、乙酸銨、乙酸(分析純)。

1.2 赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

移取一定體積的赭曲霉毒素 A 溶液標(biāo)準(zhǔn)樣品，使用流動(dòng)相稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度為0.012 5 ～0.5 ng/mL。

1.3 試劑配制

1.3.1 樣品提取液： 60%乙腈水(V/V)，量取400 mL超純水和600 mL乙腈，超聲15 min。

1.3.2 樣品稀釋液：含3% Tween-20(m/V)水溶液，稱取3 g Tween-20溶于100 mL超純水。

1.3.3 流動(dòng)相A：2%乙酸水，量取1 000 mL超純水，加入20 mL冰乙酸，超聲15 min。

1.3.4 活化液(1A)：20 mmol 乙酸銨，調(diào)節(jié)pH至6.80-7.00。

1.3.5 淋洗液(1D)：20 mmol乙酸銨 和22.5 mM硼砂以及0.9% Triton X-100的水/甲醇溶液(90/10，V/V/V)，調(diào)節(jié)pH至8.3-8.5。

1.3.6 洗脫液：含20 mM乙酸銨的水/乙腈/乙酸(33/60/7，V/V/V)。

1.4 在線固相萃取-高效液相色譜法測定條件

液相色譜條件(表1)：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；進(jìn)樣量1 000 μL；流速1.0 mL/min；柱溫27 ℃；熒光檢測器激發(fā)波長：333 nm，發(fā)射波長：460 nm；流動(dòng)相為2%乙酸水(A)∶乙腈(B)=50∶50。

表1 RIDA? CREST 在線固相萃取條件

注：a為Aspirate(吸取)；b為Dispense(分配)。

1.5 樣品制備

將混合均勻的玉米粉、小麥粉樣品及過夜后的加標(biāo)樣品5.0 g，加入20 mL提取液，振蕩提取30 min，于8 000 r/min下離心5min，取適量上清液用稀釋液稀釋10倍，將稀釋液置于進(jìn)樣瓶中備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取液的優(yōu)化

通過查閱文獻(xiàn)和現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)糧食基體中提取赭曲霉毒素A的提取液進(jìn)行匯總，結(jié)果見表2。

表2 不同糧食基體中赭曲霉毒素A提取液的選擇

從表2可知，赭曲霉毒素A的提取方法主要為乙腈水體系、甲醇水體系。本研究考察60%乙腈水、80%乙腈水和80%甲醇水對(duì)小麥、玉米中赭曲霉毒素A提取效果的影響，確立最佳的提取溶劑。選用自然污染的、混合均勻的質(zhì)控樣品進(jìn)行驗(yàn)證，其余處理方法按照1.4進(jìn)行，檢測結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取液的提取結(jié)果(n=6)

從圖1可知，小麥基質(zhì)中乙腈水的提取效率優(yōu)于甲醇水。通過單因素方法分析可知，80%甲醇水與60%的乙腈水和80%乙腈水間結(jié)果存在顯著差異(F統(tǒng)>4.965)，60%乙腈水和80%乙腈水間測定結(jié)果差異不顯著(F統(tǒng)<4.965)。玉米基質(zhì)中3種提取液的測定結(jié)果之間差異不顯著(F統(tǒng)<4.965)。考慮OTA在線固相萃取小柱對(duì)乙腈耐受程度不高(<8%)，為提高萃取柱重復(fù)使用次數(shù)，結(jié)合2種基質(zhì)的提取結(jié)果，選擇60%乙腈水作為提取液。

2.2 在線固相萃取系統(tǒng)中淋洗液的優(yōu)化

研究優(yōu)化RIDA?CREST 在線固相萃取條件中淋洗液參數(shù)，常用的淋洗液為：含有20 mM乙酸銨、22.5 mM硼砂和0.9% Triton X-100的水溶液，調(diào)節(jié)pH至8.3～8.5。本研究針對(duì)OTA的溶解特性，在常用淋洗液的基礎(chǔ)上，添加甲醇，使淋洗液中甲醇含量分別為6%、8%、10%、12%和15%(V/V)，考察淋洗效果。選用小麥樣本基質(zhì)液加標(biāo)處理，結(jié)果見表3。

表3 淋洗液對(duì)回收率的影響(n=6)

從表3可知，當(dāng)淋洗液中甲醇含量為10%時(shí)，回收率為99%，滿足檢測的需求。甲醇含量在6%和8%時(shí)，由于淋洗不干凈、有雜質(zhì)干擾、信號(hào)偏高，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏高。甲醇含量在12%和15%時(shí)檢測結(jié)果偏高，可能由于甲醇含量過高改變了原有淋洗液酸堿度體系，導(dǎo)致其凈化能力降低。綜合考慮，選擇甲醇含量為10%的淋洗液。

2.3 在線固相萃取系統(tǒng)中洗脫液體積的優(yōu)化

OtaTest在線固相萃取柱推薦的洗脫液是含20 mol/L乙酸銨的水/乙腈/乙酸(33/60/7，V/V/V)，在線凈化的洗脫液全部注入液相色譜柱中，所以需要對(duì)洗脫液的洗脫體積進(jìn)行優(yōu)化。本研究主要考察了200、300、400L的洗脫體積對(duì)OtaTest在線固相萃取柱柱回收的影響。采用陰性小麥樣本基質(zhì)液加標(biāo)處理，結(jié)果見表4。

表4 洗脫液體積對(duì)回收率的影響(n=6)

2.4 在線固相萃取柱重復(fù)使用次數(shù)的確定

通過陰性小麥樣品加標(biāo)回收率檢測在線固相萃取柱重復(fù)使用次數(shù)，加標(biāo)量為5.0g/kg，經(jīng)在線赭曲霉毒素A免疫親和柱凈化、檢測。連續(xù)進(jìn)樣60次。連續(xù)測定60次加標(biāo)回收率的平均值100.7%，變異系數(shù)9.6%。參考GB 5009.22—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》[25]中免疫親和柱柱回收率，大于等于80%即為可用商品。赭曲霉毒素A小柱完全滿足檢測需求。每支在線固相萃取柱重復(fù)使用次數(shù)為60次，使用成本與進(jìn)口免疫親和柱相當(dāng)。在線凈化系統(tǒng)可以連續(xù)使用24 h，同時(shí)，RIDA?CREST在線固相萃取儀支持2根在線固相萃取柱同步凈化和分析， 24 h可凈化并檢測100個(gè)樣品，顯著提高了檢測效率，節(jié)省了時(shí)間和人力成本，顯著優(yōu)于常規(guī)離線凈化高效液相色譜檢測方法。

2.5 方法的線性范圍與檢出限

按1.2配制赭曲霉毒素A系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.4的色譜條件下，經(jīng)在線免疫親和柱處理檢測，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，對(duì)應(yīng)赭曲霉毒素A質(zhì)量濃度(g/L)為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線的線性范圍是質(zhì)量0.012 5～0.5g/L，線性方程是y=158.378 8x+42.78，R2值為0.999 8，符合GB/T 27417—2017對(duì)方法線性的要求(定量方法R2≥0.99)[26]。根據(jù)3倍信噪比的峰響應(yīng)值和樣品提取凈化的稀釋倍數(shù)，計(jì)算出方法檢出限為0.24 μg/kg，10倍信噪比的峰響應(yīng)值和樣品提取凈化的稀釋倍數(shù)，計(jì)算出方法定量限為0.50 μg/kg，優(yōu)于GB/T 5009.96—2016赭曲霉毒素A的檢出限和定量限，顯著提高了靈敏度。

圖2 赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)免疫親和柱處理線性范圍液相色譜圖

2.6 方法的精密度與準(zhǔn)確性

采用OTA添加量為5 μg/kg的陰性小麥粉樣品，考察方法的精密度。重復(fù)測量7 d，每天測 3次，5個(gè)平行樣。采用本方法對(duì)添加OTA的小麥粉、玉米粉陰性樣品考察方法的準(zhǔn)確性。添加量分別為1、5、10 μg/kg，每個(gè)濃度做6個(gè)平行樣檢測，結(jié)果見表4。本方法的加標(biāo)回收率為80.1%～106.9%，變異系數(shù)為2.4%～8.2%。OTA檢測方法的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.2%，日間RSD為8.7%，加標(biāo)回收率為為80.1%～106.9%，變異系數(shù)為2.4%～8.2%。方法的精密度和準(zhǔn)確性滿足國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求[27-28]。

表5 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.7 在線凈化液相色譜法、離線凈化液相色譜法、穩(wěn)定同位素稀釋LC-MS/MS法比較

選用FAPAS能力驗(yàn)證玉米粉樣品，經(jīng)振蕩提取后，提取液分成3份，1份用于同位素稀釋LC-MS/MS法檢測；1份用于在線凈化-液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分析；1份用于離線免疫親和柱凈化液相色譜法。結(jié)果見表6。

表6 在線凈化、離線凈化與LC-MS/MS三種方法測定結(jié)果比較

FAPAS玉米粉中赭曲霉毒素A的中間值為3.57 μg/kg，范圍是2.00～5.14 μg/kg。從表6結(jié)果看，3種方法檢測結(jié)果平均值均在中間值附近，極差接近。同時(shí)通過赭曲霉毒素A定性離子可以判斷提取液中目標(biāo)毒素為赭曲霉毒素A，說明使用的在線免疫親和柱專一性符合要求。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中赭曲霉毒素A二級(jí)質(zhì)譜圖比較

2.8 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本方法對(duì)來自某地區(qū)的 10 份糧食樣品(小麥、玉米) 進(jìn)行赭曲霉毒素A的分析，僅有1份小麥樣品有污染，其含量為5.25 μg/kg，其余樣品未檢出或含量在0.5 μg/kg以下。實(shí)際樣品分析結(jié)果表明，本方法能夠滿足對(duì)樣品靈敏、快速、高通量的檢測要求，適用于糧食中赭曲霉毒素A全自動(dòng)在線凈化的高通量測定。

3 結(jié)論

本研究建立了在線免疫親和凈化-液相色譜快速測定糧食中赭曲霉毒素A的方法，并對(duì)提取液和淋洗液條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，赭曲霉毒素A在0.012 5～0.5 μg/kg范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，R2值為0.999 8。根據(jù)3倍信噪比的峰響應(yīng)值，確定赭曲霉毒素A的檢出限為0.24 μg/kg，赭曲霉毒素A在小麥、玉米樣品中加標(biāo)回收率為80.1%～106.9%，變異系數(shù)為2.4%～8.2%。本方法樣品凈化和檢測同步在線進(jìn)行，操作簡單，靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度等均符合檢測需要。同時(shí)，該方法支持高通量樣品檢測，一次裝柱(2個(gè))，24 h可以檢測100個(gè)樣品，優(yōu)于常規(guī)離線凈化檢測方法，檢測效率高，可用于大批量糧食樣品的處理檢測。