肖朝耿 葉 沁， 盧文靜 諶 迪 唐宏剛 楊慧娟 孟祥河 陳黎洪

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所1, 杭州 310021)(浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院2, 杭州 310014)

稻谷是世界上最重要的糧食作物之一，而我國作為世界上最大的稻谷生產(chǎn)國，近幾年的稻谷生產(chǎn)量大約為2億t。隨著生活水平的提高，人們對于稻米的質(zhì)量要求也日漸提升。而稻谷中蛋白質(zhì)含量是影響稻米食用品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一。研究表明，稻谷蛋白質(zhì)含量與蒸煮品質(zhì)之間有密切的負(fù)相關(guān)，且蛋白質(zhì)含量的變化直接影響其他成分含量的變化[1-2]。因此，準(zhǔn)確測定稻谷中蛋白質(zhì)的含量對評價稻谷品質(zhì)至關(guān)重要。目前常用的蛋白質(zhì)含量測定方法有凱氏定氮法、雙縮脲法、染料結(jié)合法、紫外分光光度法等[3]，但這些方法均存在操作繁瑣、檢測周期長、分析效率低、需要消耗大量的有機(jī)試劑、對環(huán)境不友好等問題。因此尋找一種更為快速、準(zhǔn)確的稻米蛋白質(zhì)含量分析方法十分必要。

作為一種快速無損的分析方法，紅外光譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于稻谷脂肪酸、直鏈淀粉、膠稠度等指標(biāo)的檢測，成為谷物品質(zhì)分析的重要手段[4-6]。然而對于紅外光譜技術(shù)測定稻谷中蛋白質(zhì)含量的分析，目前的研究主要集中于近紅外光譜技術(shù)(NIR)。例如Sohn等[7]利用近紅外光譜技術(shù)，經(jīng)平滑、歸一化及二階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理后結(jié)合偏最小二乘法(PLS)對大米中的蛋白含量進(jìn)行了測定，所建模型的交叉相互驗(yàn)證校正均方差為0.22。俞法明等[8]同樣利用NIR對稻谷、糙米、精米和精米粉的樣品波譜進(jìn)行預(yù)處理后結(jié)合PLS分別建立了稻米蛋白質(zhì)含量的預(yù)測模型，所得交叉驗(yàn)證均方差分別為0.507、0.379、0.336、0.258。此外，謝新華等[9]利用近紅外谷物分析儀結(jié)合計量數(shù)學(xué)處理方法建立了單粒糙米蛋白質(zhì)含量測定的近紅外定標(biāo)模型，其標(biāo)準(zhǔn)集的相關(guān)系數(shù)為0.924。然而近紅外光譜技術(shù)在稻米蛋白質(zhì)含量測定上雖已有較多研究，但相比中紅外光譜技術(shù)，仍存在靈敏度低、無法直觀給出特征基團(tuán)信息等缺點(diǎn)。而目前中紅外光譜技術(shù)關(guān)于蛋白質(zhì)的分析研究，主要集中在利用中紅外光譜技術(shù)定性分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等問題上[10]，而關(guān)于利用中紅外光譜技術(shù)定量分析稻谷中蛋白質(zhì)含量的研究還鮮有報道。

本研究旨在利用中紅外漫反射光譜技術(shù)(DR-FTIR)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)的方法，通過波譜預(yù)處理及波譜區(qū)間優(yōu)化選擇，構(gòu)建稻谷中蛋白質(zhì)定量檢測模型，同時對比研究了DR-NIR與DR-FTIR快速定量分析稻谷中蛋白質(zhì)含量技術(shù)，以期為稻谷的品質(zhì)檢測技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試的180份稻米樣品均由杭州市糧油檢測中心站提供，包括57份粳稻谷、60份晚秈稻谷、63份早秈稻谷。所用樣品經(jīng)過礱谷機(jī)、高速實(shí)驗(yàn)粉碎磨研磨成精米，經(jīng)150目(106 μm)篩子過篩處理后，儲藏于4 ℃冰箱備用。

硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、氫氧化鈉、95%乙醇等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BRUKER TENSOR 27傅里葉變換紅外光譜儀；AntarisTMⅡ近紅外光譜儀；3100型高速實(shí)驗(yàn)粉碎磨研磨儀；消化爐；半自動凱式定氮儀。

1.3 蛋白質(zhì)理化值的測定

稻米直鏈淀粉含量理化值的測定按照GB/T 5009.5—2010中第一法(凱氏定氮法)進(jìn)行測定。每個樣品測定3次，取其平均值。

1.4 紅外光譜的采集

中紅外漫反射光譜的采集，利用BRUKER TENSOR 27 傅里葉變換紅外光譜儀(配有漫反射采樣系統(tǒng))采集樣品光譜。樣品上樣量為80 μg，選用樣品杯的規(guī)格為直徑10 mm，深度為2.3 mm，同時使樣品狀態(tài)盡量保持一致。紅外光譜測定范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)32次，分辨率為4 cm-1，測量環(huán)境的濕度小于70%，溫度保持在25 ℃。以KBr作為背景，光譜數(shù)據(jù)以log(1/R)形式表示。為了減少樣品光譜采集誤差，每個樣品采集3次光譜。

近紅外漫反射光譜采集，利用近紅外光譜儀(配有RESULT-Integration操作軟件)采集樣品光譜；測定范圍10 000～4 000 cm-1，掃描次數(shù)32次，分辨率4 cm-1。每個樣品采集3次，取平均波譜。

1.5 模型的建立

采用TQ Analyst 光譜分析軟件對所得的紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理及模型的構(gòu)建，通過對紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理，可以優(yōu)化所建立的模型。預(yù)處理方法包括矢量標(biāo)準(zhǔn)歸一化(SNV)、多元散射校正(MSC)、一階導(dǎo)數(shù)(FD)、二階導(dǎo)數(shù)(SD)、自動平滑等。

采用偏最小二乘法(PLS)建立定量模型，建模樣品約占2/3，其余樣品用于驗(yàn)證分析。同時通過采用區(qū)間偏最小二乘法(iPLS)，向后偏最小二乘法(biPLS)，以及向前偏最小二乘法(fiPLS)進(jìn)行波譜區(qū)間選擇[11-12]，實(shí)現(xiàn)模型的優(yōu)化。通過校正相關(guān)系數(shù)(R)，交叉相互校正均方差(RMSEC)、預(yù)測均方差(RMSEP)及殘差預(yù)測偏差(RPD)評價模型效果[13]。R越接近1，RMSEC和RMSEP的值越小，則表明模型的穩(wěn)定性越好。而RPD越大，且大于3時表明模型具有較高的預(yù)測性[14]。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所得紅外光譜分別通過TQ Analyst分析軟件結(jié)合PLS進(jìn)行相應(yīng)的波譜模型分析，同時利用Origin 8.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)理化指標(biāo)

180種來自不同地區(qū)的稻谷樣品經(jīng)輾米機(jī)去殼、精米機(jī)去除糙米層、粉碎機(jī)磨粉后，根據(jù)GB 5009.5—2010對其進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定。結(jié)果顯示，其蛋白質(zhì)含量范圍為7.03～10.74 g/100 g，其中測定結(jié)果最大值為10.74 g/100 g，最小值為7.03 g/100 g，平均值為8.69 g/100 g。

圖1 精米樣品蛋白質(zhì)含量頻率分布

2.2 波譜信息

圖2b是精米近紅外漫反射典型的紅外光譜圖，8 840～8 655 cm-1和5 974 cm-1是C—H的伸縮振動，7 220～7 050 cm-1和5 399～5 245 cm-1是O—H的對稱和反對稱伸縮振動[18]。相比于近紅外光譜，中紅外光譜提供了更多的基團(tuán)振動峰信息，且波譜響應(yīng)比近紅外更強(qiáng)[19]。

a 中紅外光譜

b 近紅外光譜

圖2 精米粉中紅外及近紅外光譜圖

2.3 波譜預(yù)處理

通過對180個稻谷樣品的DR-FTIR和DR-NIR光譜圖開發(fā)不同的PLS回歸模型并分別預(yù)測蛋白含量，同時通過不同的預(yù)處理方法對相應(yīng)的波譜信號進(jìn)行校正，所得結(jié)果列于表1中。由表1可以看出，DR-FTIR和DR-NIR波譜經(jīng)過SNV、FD、SD處理后，其模型效果并未得到改善。而經(jīng)過MSC處理后，所得模型的R、RMSEC、RMESP均有所提高。這可能是因?yàn)镸SC可以消除顆粒分布不均勻及顆粒大小對漫反射光譜帶來的影響[20]。

在MSC預(yù)處理的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對波譜進(jìn)行多項式卷積(Savitzky-Golay多項式法)平滑預(yù)處理，其結(jié)果顯示DR-NIR通過3點(diǎn)平滑處理時，所得模型效果達(dá)到最優(yōu)，其R、RMSEC、RMESP、RPD分別為0.895 6、0.75、0.92、1.28。而DR-FTIR波譜經(jīng)過5點(diǎn)平滑處理時，所得模型效果最優(yōu)，其R、RMSEC、RMESP、RPD分別為0.939 0、0.66、0.83、1.42，DR-FTIR模型效果略優(yōu)于DR-NIR。

表1 波譜預(yù)處理對稻谷蛋白含量模型穩(wěn)定性的影響

2.4 波譜區(qū)間優(yōu)化

表2 波譜區(qū)間優(yōu)化對DR-FTIR稻米蛋白含量模型效果的影響

與全波譜相比，經(jīng)波譜區(qū)間優(yōu)化后DR-NIR的蛋白含量模型效果均有不同程度的改善，R從0.895 6提高至0.936 9～0.960 7，RMSEC從0.75降至0.34～0.58，RMSEP從1.21降至0.40～0.71。尤其biPLS-34模型的RPD為2.96，模型表現(xiàn)出較好的預(yù)測能力。俞法明等[8]同樣利用近紅外光譜技術(shù)對精米和精米粉的樣品波譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)和MSC預(yù)處理后結(jié)合PLS建立了稻米蛋白質(zhì)含量的預(yù)測模型，所得RMSEC分別為0.336、0.258。然而相比DR-FTIR的蛋白含量模型而言，DR-NIR的模型效果仍不及DR-FTIR，這可能是因?yàn)镹IR的靈敏度明顯低于FTIR，從而導(dǎo)致DR-FTIR的蛋白含量模型效果優(yōu)于DR-NIR。

FTIR蛋白含量最優(yōu)模型的預(yù)測值與真實(shí)值之間的散點(diǎn)分布圖如圖3所示，模型預(yù)測值與化學(xué)值之間的線性關(guān)系為Y預(yù)測=0.99X實(shí)際+0.008 2，相關(guān)系數(shù)為0.992 3，說明精米中蛋白含量的預(yù)測結(jié)果均與實(shí)際值高度相關(guān)，吻合度高，說明所開發(fā)的蛋白含量的DR-FTIR分析模型準(zhǔn)確度高。

圖3 精米粉蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)集與預(yù)測集的紅外預(yù)測值與真實(shí)值之間的線性關(guān)系

2.5 模型的外部驗(yàn)證

模型建立后，隨機(jī)選取10組不同地區(qū)不同年份的稻米樣品，驗(yàn)證分析模型的準(zhǔn)確性，見表3，其中DR-FTIR模型預(yù)測組的平均相對誤差為1.72%，DR-NIR模型預(yù)測組為3.04%，DR-FTIR的預(yù)測效果明顯優(yōu)于DR-NIR。吳金紅等[23]利用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合PLS分別建立了不同品種稻谷蛋白質(zhì)含量回歸模型，結(jié)果表明所建立的模型具有良好的預(yù)測能力，其外部驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)為0.786 1～0.931 5。Himmelsbach等[24]同樣利用NIR結(jié)合PLS，通過基線校正和歸一化預(yù)處理后構(gòu)建了精米中蛋白質(zhì)含量的快速檢測模型，其所得模型的相關(guān)系數(shù)R為0.992，外部驗(yàn)證的均方差為0.138。但這些模型的預(yù)測效果均不如本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其原因可能是因?yàn)橹屑t外光譜的靈敏度明顯優(yōu)于近紅外光譜，且中紅外光譜可以直觀給出特征基團(tuán)信息，這也間接證明了中紅外漫反射光譜結(jié)合biPLS法對于構(gòu)建精米粉中蛋白含量分析模型的有效性。

表3 DR-FTIR和DR-NIR準(zhǔn)確性驗(yàn)證結(jié)果

3 結(jié)論

本研究對比了DR-FTIR和DR-NIR在分析精米粉蛋白質(zhì)含量中的可行性，經(jīng)分析比較發(fā)現(xiàn)DR-FTIR和DR-NIR均可用于精米粉蛋白質(zhì)含量的快速測定。但當(dāng)DR-FTIR結(jié)合PLS建模，波譜通過MSC、卷積平滑預(yù)處理，biPLS波譜選擇優(yōu)化后，所得模型效果優(yōu)于DR-NIR。此時建模區(qū)間為1 700～1 400,1 300～1 200, 900～600 cm-1，相應(yīng)的R為0.990 1，RMSEC、RMSE分別為0.13、0.25。此外，在模型的準(zhǔn)確性中，其外部驗(yàn)證樣品的紅外預(yù)測值與實(shí)際值相對誤差為1.72%，說明本研究所建立的精米粉蛋白質(zhì)含量的DR-FTIR模型有效，同時該方法也對稻米的質(zhì)量監(jiān)控和監(jiān)管具有重要的指導(dǎo)意義。