蘇建峰 陳勁星 連文浩 馬 瑩 徐 佳 沈 松 劉建軍,

(福建中檢華日食品安全檢測有限公司1，福州 350008) (空軍第一后勤訓(xùn)練基地2，上海 200120)(中國檢驗認(rèn)證集團(tuán)福建有限公司3，福州 350015)

橄欖油是由新鮮的油橄欖果實冷榨而成，不經(jīng)加熱和化學(xué)處理，保留了天然營養(yǎng)成分，營養(yǎng)價值高。由于橄欖在種植和生長過程中使用農(nóng)藥用于防治蟲害，且部分農(nóng)藥不易降解，致使橄欖油中可能存在農(nóng)藥殘留。橄欖油中含有大量油脂，基質(zhì)干擾大，屬于較難分析的樣品類型。由于農(nóng)藥多殘留技術(shù)[1-10]監(jiān)測項目范圍廣，優(yōu)勢顯著，近年來已有不少植物油中農(nóng)藥多殘留分析的研究報道[11-20]，主要采用凝膠滲透色譜[13-15](GPC)凈化、色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析，GPC在油脂凈化方面效果較好，但需要專門設(shè)備，并且效率不高；其他如冷凍、分散固相萃取法等[16-17]快速法效率較高，但對油脂中大量干擾基質(zhì)的凈化效果一般，常需配合二級串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS、GC-MS/MS)的強抗干擾性進(jìn)行分析，且基質(zhì)效應(yīng)較強影響定量結(jié)果；傳統(tǒng)的液液分配法、固相萃取法等[18-19]多用于分析某一兩類(如有機磷類、菊酯類等)農(nóng)藥幾種或幾十種，適用范圍較窄。

本研究建立并優(yōu)化串聯(lián)雙柱凈化方案，用于橄欖油中農(nóng)藥多殘留分析前處理，操作迅速、適用項目范圍遠(yuǎn)超已有的文獻(xiàn)報道(在進(jìn)出口農(nóng)藥篩查品種的基礎(chǔ)上進(jìn)一步擴充，跨種類達(dá)313種農(nóng)藥)，并且項目列表中包含了多殘留分析技術(shù)較難并入的部分農(nóng)藥如：乙酰甲胺磷、百菌清等。在儀器測試方面，考察了該前處理凈化方案在不同儀器上的效果，結(jié)果表明，各儀器的譜圖均呈現(xiàn)較優(yōu)的凈化效果，可依據(jù)具體情況選擇配合GC-MS、GC-ECD或GC-FPD進(jìn)行測定，實用性強，滿足高通量樣品的檢測需求，文中對實驗的前處理和儀器測定參數(shù)進(jìn)行了探討。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，7683自動進(jìn)樣器，EI源；Clarus 680氣相色譜儀，ECD檢測器，F(xiàn)PD檢測器；色譜柱：DB-5MS毛細(xì)管柱30 m×0.25 mm×0.25 μm，HP-5毛細(xì)管柱30 m×0.32 mm×0.25 μm，DB-1701毛細(xì)管柱30 m×0.32 mm×0.25 μm；313種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(逐級稀釋后備用)；Envi-18、PSA固相萃取小柱。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

稱取5 g橄欖油至燒杯中，加入20 mL正己烷，充分?jǐn)嚢杌靹蚝蟮谷?50 mL分液漏斗中，5 mL正己烷清洗燒杯后并入分液漏斗，在分液漏斗加入30 mL正己烷飽和乙腈、10 mL飽和氯化鈉，振蕩靜置分層，棄去下層氯化鈉水溶液，收集中間乙腈層經(jīng)漏斗濾入雞心瓶中(漏斗上預(yù)置無水Na2SO4層)，再用30 mL正己烷飽和乙腈萃取一次，合并萃取液至雞心瓶中，40 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約2～5 mL，過Envi-18和PSA串聯(lián)雙柱(10 mL乙腈預(yù)活化)，5 mL乙腈清洗雞心瓶(配合超聲波)后一并上柱，用乙腈繼續(xù)洗脫，全部收集，至洗脫液達(dá)到20 mL時停止，在40 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用丙酮+正己烷(1+1)溶劑定容至1 mL上機。

1.2.2 色譜和質(zhì)譜條件

氣相色譜條件：ECD，載氣為氮氣(純度為99.999%)，流速2.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度為260 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，不分流進(jìn)樣，檢測器溫度為300 ℃。FPD，載氣為氮氣(純度為99.999%)，流速為2.0 mL/min，尾吹流量為60 mL/min，氫氣(純度為99.999%)流量為75 mL/min，空氣流量為100 mL/min。進(jìn)樣口溫度為220 ℃，進(jìn)樣量為1μL，不分流進(jìn)樣，檢測器溫度為250 ℃。

氣相色譜-質(zhì)譜條件：載氣為氦氣(純?yōu)槎?9.999%)，恒流模式，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度為260 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，不分流進(jìn)樣，色譜-質(zhì)譜接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，離子化方式為EI，電子能量為70 eV，倍增器電壓在自動調(diào)諧后加400 V。313種農(nóng)藥的色譜分離譜圖見圖1, 其他相關(guān)參數(shù)見表1。

圖1 313種農(nóng)藥混標(biāo)選擇監(jiān)測總離子流色譜圖

表1 選擇離子監(jiān)測待測農(nóng)藥的保留時間、定量離子、定性離子

續(xù)表1

續(xù)表1

注：黑體為定量離子。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件的選擇

橄欖油的主要成分為油脂，它的存在會對后續(xù)分析帶來強烈的干擾，乙腈中可溶入的油脂量極少，對絕大多數(shù)農(nóng)藥溶解度則較大，故采用乙腈來作為橄欖油中農(nóng)藥殘留的提取溶劑。實驗中先使用正己烷對橄欖油進(jìn)行溶解，乙腈反提取，正己烷-乙腈-鹽水三相分配，其中油脂溶于正己烷相，水溶性雜質(zhì)溶于水相，農(nóng)藥組分轉(zhuǎn)移至乙腈相中，隨農(nóng)藥組分進(jìn)入乙腈相的部分油脂和其他雜質(zhì)則采用SPE手段進(jìn)行凈化。

試驗Envi-18柱、PSA柱、NH2柱、Carb柱、Florisil柱的各種組合對本實驗提取液的凈化效果。由于油脂是主要干擾雜質(zhì)，故Envi-18柱必選；Florisil柱中的鎂化硅膠會對極性農(nóng)藥產(chǎn)生強吸附，象甲胺磷、氧化樂果等農(nóng)藥回收率極差，加強洗脫溶劑的極性也不能有效改善，故該柱由于其適用范圍窄而排除；Carb柱中含層狀石墨碳結(jié)構(gòu)，某些農(nóng)藥分子中含平面環(huán)狀結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)與石墨碳中的六方層狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生強吸附，很難洗脫，導(dǎo)致回收率大幅下降，若一定要洗脫來提高回收率的話，必需使用含高比例甲苯或苯的溶劑，這直接導(dǎo)致該柱與Envi-18柱組合使用時除油脂的效果很差，也排除；PSA柱和NH2柱效果相當(dāng)，由于相同規(guī)格的PSA柱比NH2柱吸附容量大，故選用PSA柱與Envi-18柱組合成串聯(lián)雙柱。雙柱分別吸附非極性和強極性雜質(zhì)，互為補充，其中，Envi-18柱的硅膠骨架上的十八烷基官能團(tuán)在與乙腈配合使用時對油脂的去除有十分顯著的效果，同時還可以除去其他一些非極性的雜質(zhì)如色素中的非極性組分等[5,9]。PSA柱的硅膠表面鍵合有極性官能團(tuán)，它能利用氫鍵吸附的原理從樣品中吸附極性化合物[9]，與乙腈配合使用時，絕大部分農(nóng)藥均可定量洗脫，而強極性雜質(zhì)如有機酸、部分色素等還吸附在PSA填料上。實驗時雙柱串聯(lián)，僅使用一種溶劑過柱，簡單快速，實際操作時，應(yīng)在活化時先控制好流速，可采用預(yù)調(diào)節(jié)方法來實現(xiàn)平穩(wěn)的流速：先用乙腈調(diào)節(jié)，若流出不暢，可摘下Envi-18柱讓PSA柱上的乙腈自行往下流，流速合適時迅速插上Envi-18柱，即可獲得整體平穩(wěn)的流速，然后將提取液上柱，以免串聯(lián)柱內(nèi)形成內(nèi)壓導(dǎo)致洗脫液流出不暢。

2.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

一般建立氣質(zhì)聯(lián)用測定幾百種農(nóng)藥多殘留的儀器條件較為耗時繁瑣，本研究在配合質(zhì)譜庫和相關(guān)文獻(xiàn)[4,7]參數(shù)的情況下，采用速成法進(jìn)行：

先配置1～5 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用質(zhì)譜全掃描方式、通用型氣相柱溫程序進(jìn)行走樣，設(shè)定較長的高溫程序段，以確保高沸點農(nóng)藥組分可以流出色譜柱，此時觀察譜圖中色譜峰的分布，對柱溫程序進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)：色譜峰較密集的區(qū)域，減緩該區(qū)域?qū)?yīng)保留時間段的升溫速率，反之，則加快速率，綜合考慮效率對柱溫進(jìn)行調(diào)整，使整張譜圖中色譜峰的分布相對均勻，值得注意的是，柱溫程序的變化對出峰時間的影響具有滯后性，部分目標(biāo)區(qū)域的調(diào)節(jié)效果不佳，此時將調(diào)節(jié)區(qū)域提前，可獲得不同的分離效果。

依據(jù)質(zhì)譜庫和相關(guān)文獻(xiàn)參數(shù)確定各農(nóng)藥組分的可能特征離子，再利用各農(nóng)藥組分的特征離子確定保留時間，對于無法確認(rèn)歸屬的少量農(nóng)藥組分(如：響應(yīng)值較低、同分異構(gòu)體、相似結(jié)構(gòu)等)則需使用單標(biāo)進(jìn)行確認(rèn)。同時，通過調(diào)整氣化溫度對特殊農(nóng)藥是否分解、是否無法氣化等加以確認(rèn)，將個別無法使用氣質(zhì)聯(lián)用測試的農(nóng)藥剔除出去。

通過綜合考查特異性、豐度比、質(zhì)量數(shù)的因素，挑選3個離子進(jìn)行監(jiān)測，再依據(jù)步驟2中確認(rèn)的保留時間來分組，調(diào)整駐留時間(Dwell time)使每組的循環(huán)掃描次數(shù)在每秒3次左右，保證每個完整的離子流色譜峰包含足夠的采點數(shù)，以免峰形失真影響精密度。

2.3 氣相色譜-質(zhì)譜測定結(jié)果

采用本法處理的某進(jìn)口初榨橄欖油樣品選擇監(jiān)測總離子流色譜圖見圖2(B組)，如圖所示：總離子流色譜圖中沒有出現(xiàn)成片的或比例非常懸殊的雜質(zhì)峰，在保留時間為36～36.5min有一個較大的雜質(zhì)峰，經(jīng)優(yōu)化分離條件后，僅2個農(nóng)藥(氟苯嘧啶醇、戊唑醇)在該區(qū)域出峰，這2個農(nóng)藥的定量離子為m/z 314、m/z250，離子質(zhì)量數(shù)較大，不受該種程度的雜質(zhì)峰的影響，其他位置的干擾峰都較小。經(jīng)優(yōu)化監(jiān)測離子，本前處理方法所處理的橄欖油中各農(nóng)藥的定量離子基本不受基質(zhì)干擾，有少部分農(nóng)藥的定性離子有干擾，由于此部分離子僅供定性用，故其干擾幅度尚可接受。該進(jìn)口初榨橄欖油中檢出的2種農(nóng)藥提取離子流色譜圖如圖2所示：倍硫磷檢出值為0.032 mg/kg，腐霉利檢出值為0.11 mg/kg，m/z153譜圖基線抖動，并且在靠近該峰的前部有小幅干擾，這是因為m/z153離子質(zhì)量數(shù)和豐度比均較小，抗干擾性不強，容易受到干擾，在本研究中，該離子僅供定性用，不涉及準(zhǔn)確定量，故滿足實驗要求。其他離子m/z278、m/z169、m/z285、m/z283、m/z255的譜圖均沒有干擾，信噪比很高。

圖2 初榨橄欖油樣品選擇離子監(jiān)測總離子流色譜圖及陽性農(nóng)藥(倍硫磷、腐霉利)提取離子流色譜圖

2.4 氣相色譜測定結(jié)果

圖3 某進(jìn)口初榨橄欖油樣品的GC-ECD色譜圖(檢出腐霉利)

試驗考察了本前處理的凈化方案在氣相色譜(GC-ECD、GC-FPD)上的適用性。GC-ECD譜圖見圖3：圖中有相當(dāng)數(shù)量的雜質(zhì)峰，這是因為ECD檢測器雖然靈敏度高，但選擇性一般，許多雜質(zhì)也含有電負(fù)性基團(tuán)導(dǎo)致在譜圖中形成干擾信號，由于干擾信號強度不大，譜圖放大后其基線情況還是可以接受的。本例進(jìn)口初榨橄欖油樣品中檢出腐霉利0.11 mg/kg，其實際信噪比很高，完全滿足定量要求，由于有機氯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在ECD檢測器上普遍響應(yīng)值很高(腐霉利算相對低的)，而雜質(zhì)峰的高度相對于目標(biāo)物來說不算高，并且各雜質(zhì)峰峰形較尖銳，所以本法中，有機氯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥很容易通過放大譜圖、調(diào)整升溫程序或更換色譜柱實現(xiàn)與雜質(zhì)峰的分離，進(jìn)而進(jìn)行定性定量。GC- FPD譜圖見圖4：由于FPD檢測器的高選擇性，未出現(xiàn)較大的雜質(zhì)峰，在保留時間約為9.2、10.9、14.1 min處有很小的雜質(zhì)峰，在保留時間約為16.8、17.7min處有輕微基線抖動。經(jīng)觀察，基線抖動只是個別批次實驗時出現(xiàn)，大部分情況下沒有，將色譜柱設(shè)置280 ℃烘烤2 h后重新走樣，發(fā)現(xiàn)該處的基線回復(fù)為平線，這是由于色譜柱中殘留有少量高沸點物質(zhì)，在高溫階段流出色譜柱，進(jìn)入火焰光度檢測器時，影響到檢測器中氫火焰的燃燒狀態(tài)，使氫火焰的發(fā)光強度等發(fā)生變化[3]，同時由于它們在氣化后體積膨脹，而色譜柱內(nèi)徑較細(xì)，無法同時流出色譜柱，最終呈連續(xù)流出狀態(tài)導(dǎo)致基線出現(xiàn)輕微的抖動。由于這些雜質(zhì)峰和基線抖動幅度都非常小(參照圖4中0.032 mg/kg倍硫磷的響應(yīng)值)，相對于有機磷農(nóng)藥的響應(yīng)值來說基本可忽略不計，整體信噪比非常高，可進(jìn)行定性定量。對于出峰時間較早的幾種有機磷如甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化樂果等，GC-FPD法的檢出限比GC-MS法做得更低，均可達(dá)到0.01 mg/kg以下。由于氣相色譜上農(nóng)藥的保留時間容易重疊，所以一次性測試數(shù)量較少，可依據(jù)需要配置數(shù)量合適的標(biāo)液(例如十幾種一組)對需要監(jiān)控的農(nóng)藥進(jìn)行專項測定。結(jié)合GC-MS法的后續(xù)確證，本前處理方法配合氣相色譜適用于橄欖油樣品中有機磷農(nóng)藥(GC-FPD)和有機氯、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥(GC-ECD)的測定。氣相色譜測定的適用性結(jié)論僅作為本研究的附屬，故不再作進(jìn)一步技術(shù)參數(shù)考察。

圖4 某進(jìn)口初榨橄欖油樣品的GC-FPD色譜圖(檢出倍硫磷)

2.5 氣相色譜-質(zhì)譜測定檢出限、線性范圍、回收率和精密度

按本方法對添加了313種農(nóng)藥混標(biāo)的空白初榨橄欖油樣品進(jìn)行加標(biāo)回收測定，以信噪比≥3確定方法檢出限，甲胺磷、三唑醇檢出限為0.03 mg/kg，乙酰甲胺磷、氧化樂果、環(huán)莠隆、苯嗪草酮、烯丙菊酯檢出限為0.02 mg/kg，其余項目的檢出限均可達(dá)到0.01 mg/kg。方法線性范圍：0.01～0.5 mg/L，相關(guān)系數(shù)R2>0.99，在樣品中添加0.01、0.05、0.20 mg/kg水平各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，按本方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(n=6)。三個水平回收率分布范圍見表2。

表2 橄欖油樣品在0.01、0.05、0.20 mg/kg水平加標(biāo)的回收率分布范圍(n=6)

如表2所示，3個水平加標(biāo)的平均回收率共313×3-7=932個數(shù)據(jù)(7個項目檢出限大于0.01 mg/kg，故其對應(yīng)的0.01 mg/kg水平加標(biāo)數(shù)據(jù)不參與統(tǒng)計)，采用分步回收率監(jiān)控和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液對比響應(yīng)值的辦法[2]分析部分項目回收率偏差的原因：其中有一項農(nóng)藥平均回收率<50%，是百菌清，經(jīng)查，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致百菌清回收率偏低的因素有：1)由于百菌清結(jié)構(gòu)式中的甲腈基團(tuán)與樣品基質(zhì)相互作用，導(dǎo)致提取效率偏低，這可以通過在提取液中加入少量磷酸來破壞這種作用力，可以提高提取率。通過使用不同樣品基質(zhì)驗證該作用力的影響時，發(fā)現(xiàn)白蘿卜樣品基質(zhì)體現(xiàn)最明顯：在不使用磷酸來破壞這種作用力時，乙腈對百菌清的提取率<10%或提取不出來，加入少量磷酸其提取率可達(dá)70%以上。該現(xiàn)象也說明對于百菌清來說，不同樣品基質(zhì)的回收率參考意義不大。2)由于百菌清的易被吸附特點，對全程測試環(huán)境的潔凈度要求較高，例如常在襯管和色譜柱柱頭、柱尾等處發(fā)生吸附導(dǎo)致回收率偏低，若被吸附的是標(biāo)液導(dǎo)致校準(zhǔn)系列響應(yīng)值偏低則出現(xiàn)回收率虛高的現(xiàn)象。所以一般百菌清的真實回收率能達(dá)到70%就屬于較優(yōu)結(jié)果，而通用性多殘留方法中由于其前處理所用的石墨碳凈化填料對百菌清的平面芳香環(huán)結(jié)構(gòu)具有強吸附，難以洗脫，回收率不超過10%，故百菌清較難并入多殘留分析方法。本實驗將百菌清并入多殘留分析方法，平均回收率44.3%，由于其精密度尚可接受(RSD<12.6%)，故未將其剔除?；厥章式橛?0%～70%的項目主要有敵敵畏、聯(lián)苯、茵草敵、五氯苯、六氯苯，由于這些農(nóng)藥的蒸氣壓較低，揮發(fā)性較強，在前處理濃縮時，一部分農(nóng)藥組分跟隨溶劑揮發(fā)了?；厥章式橛?20%～150%的項目主要有氟啶脲、噁唑磷、吡唑硫磷、茚蟲威、豐索磷、噻唑磷、克螨特、氰戊菊酯、甲基對氧磷、對氧磷、噻螨酮，使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量，農(nóng)藥項目的實際回收率均在110%以內(nèi)，故該部分回收率的偏離應(yīng)歸因于基質(zhì)增強效應(yīng)[21-22]。由于目標(biāo)物濃度的提高能減弱基質(zhì)效應(yīng)的影響，故加標(biāo)水平為0.20 mg/kg的樣品中，其回收率介于120%～150%的項目數(shù)量大幅減少。總體上看，回收率在70%～120%之間的項目占絕大多數(shù)(93.9%)，滿足GB/T 27404—2008 《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求，個別農(nóng)藥項目回收率不甚理想但對于多殘留分析來說尚處于可接受范圍，RSD<17.8%，結(jié)果滿意。目前檢測植物油中農(nóng)藥殘留項目數(shù)最多的標(biāo)準(zhǔn)是SN/T 4428—2016《出口油料和植物油中多種農(nóng)藥殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》(77種農(nóng)藥)，該標(biāo)準(zhǔn)采用乙腈提取，分散固相萃取凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，相對來說，本法同時測定313種農(nóng)藥，速度更快，適用范圍更廣。后續(xù)試驗采用本法對大豆油、花生油、葵花籽油進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)在氣相色譜-質(zhì)譜選擇監(jiān)測模式下，定量離子和定性離子的譜圖和橄欖油的譜圖區(qū)別不大，說明本法的凈化方案亦適用于其他植物油的前處理凈化。

2.6 實際樣品分析

按本研究方法對34份進(jìn)口初榨橄欖油進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示3份檢出農(nóng)藥殘留，其中一份檢出倍硫磷0.032 mg/kg、腐霉利0.11 mg/kg。另外2份均檢出腐霉利殘留，檢出值分別為0.064、0.15 mg/kg。其余樣品中各項目均為未檢出。

3 結(jié)論

本研究基于串聯(lián)雙柱凈化方案建立了橄欖油中313種農(nóng)藥多殘留檢測的前處理方法，項目覆蓋面廣，操作快速，能有效去除油脂樣品中大量干擾雜質(zhì)。配合氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行測定，所得GC-MS、GC-ECD、GC-FPD譜圖均呈現(xiàn)良好的凈化效果。同時，采用本方法對其他植物油(大豆油、花生油、葵花籽油)進(jìn)行測定，亦獲得滿意的結(jié)果。