郭 穎 江 帆 喬麗華 王 華 梁雞保 杜雙奎

(西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院1，楊凌 712100)(渭南市食品執(zhí)法監(jiān)察支隊2，渭南 714000)(神木市農(nóng)業(yè)技術推廣中心3，神木 719300)

小粒黑大豆是豆科植物大豆(GlycinemaxL.)的黑色種子，百粒重在10～15 g，具有適應性強，耐貧瘠、耐干旱，已成為黃土高原地區(qū)主要的食用大豆資源。小粒黑大豆具有有益于人體健康的生理功能，如對吞噬細胞有免疫作用、抗衰老、清除細胞活性氧、降低血脂、預防肥胖病和動脈硬化與抗血栓等[1-5]。但小粒黑大豆含有抗營養(yǎng)因子，因此在食用前，要經(jīng)過熟制以去除抗營養(yǎng)因子，改善其食用品質。目前，小粒黑大豆的產(chǎn)品多以傳統(tǒng)的豆腐制品、豆芽為主，為提高產(chǎn)品的感官商品價值，常將其黑色種皮脫除，研究表明黑大豆種皮中含有豐富的花青素、多酚等，但常作為飼料或廢棄物遺棄，不僅浪費了寶貴資源，而且會造成環(huán)境污染，如何高效利用已成為大家關注的問題[6-8]。

焙炒作為傳統(tǒng)的使物料熟化、增香的手段廣泛應用于谷物、豆類等加工，是干熱熟化加工的一種[9]。Acar等[10]將黑豆在150 ℃烘烤10、30、60 min后，研究發(fā)現(xiàn)其總抗氧化能力逐漸增強。Kim等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與未處理的小粒黑大豆相比，150 ℃和250 ℃烤制過的小粒黑大豆有較高的DPPH·、ABTS+·清除率；經(jīng)過烤制后，酚類物質和美拉德反應產(chǎn)物都有一定程度的增加，焙烤處理可以增加大豆異黃酮苷元的含量。本研究以小粒黑大豆、黑豆皮為實驗材料，對其進行焙炒熟化處理，研究焙炒對小粒黑大豆、黑豆皮抗氧化活性和生物活性的影響，以期為小粒黑大豆、豆皮茶的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

小粒黑大豆、黑豆皮，由陜西榆林神木市農(nóng)業(yè)技術推廣中心提供。DPPH、TPTZ、2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、菲洛嗪、福林酚試劑、蘆丁、甲硫氨酸、NBT(氯化硝基四氮唑藍)、核黃素、一水沒食子酸，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 樣品焙炒處理

取適量小粒黑大豆或黑豆皮在旋轉焙炒鍋中進行焙炒熟化處理。小粒黑大豆焙炒條件為150 ℃ 80 min和210 ℃ 50 min，黑豆皮焙炒條件為110 ℃ 35 min和150 ℃ 25 min，隨后冷卻至室溫。取焙炒熟化后的樣品粉碎過60目篩，收集篩下物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 脫脂處理

稱取5 g豆粉(豆皮)，置于100 mL的磨口錐形瓶中，按1∶10加入石油醚，封口，在25 ℃，以振蕩頻率為150 次/分的振蕩器中振蕩脫脂3 h，回收石油醚，再按比例加入石油醚重復脫脂2次。脫脂后的樣品在通風櫥中放置，揮去殘留石油醚至無味，隨后在35 ℃干燥16 h，將脫脂的樣品裝袋保存，備用。

1.2.3 抗氧化活性測定

1.2.3.1 提取液制備

參考Nithiyanantham等[9]方法制備提取液，略有改動。稱取2 g脫脂樣品，用25 mL 70%丙酮(丙酮∶水∶乙酸=70∶ 29.5∶ 0.5)，25 ℃振蕩提取3 h，3 800 r/min離心10 min，收集上清液。殘留物用25 mL 70%丙酮在25 ℃再提取3 h，離心，收集上清液合并，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 總酚含量測定

采用福林酚法測定，參考Xu等[12]的方法略有改動。

取0.3 mL提取液，使其與1 mL Folin-Ciocalteu試劑反應，混勻，加入3 mL 10% Na2CO3，加蒸餾水至10 mL，室溫靜置2 h，在765 nm處測定吸光值。沒食子酸濃度與A765nm之間具有高度顯著的線性關系，線性方程為y=122.77x-0.003，決定系數(shù)R2=0.996 1。總酚含量以每g干物質含量表示。

1.2.3.3 總黃酮含量測定

總黃酮含量采用比色法測定，參考Xu等[12]的方法略有改動。配制濃度為0.356 mg/mL的蘆丁標準溶液，備用。取2.0 mL提取液，加40%乙醇至5 mL，先加0.3 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min；再加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min；最后加入4 mL 1mol/L氫氧化鈉溶液，用40%乙醇定容至10 mL，搖勻，放置15 min，于510 nm處測定吸光度。蘆丁濃度x與吸光值y之間具有高度顯著的線性關系，線性方程為y=11.594x-0.000 3，決定系數(shù)R2=0.999 5?？傸S酮含量以每g干物質含量表示。

1.2.3.4 花色苷含量測定

參考Jeng等[13]的方法略有改動。取2份豆樣提取液3.0 mL，分別用pH為1.0的0.025 mol/L KCl和pH 4.5的0.4 mol/L醋酸鈉緩沖溶液定容至10 mL。待平衡1 h后，在530、700 nm處測吸光值，計算花色苷含量?？偦ㄉ蘸?以矢車菊素-3-葡萄糖苷計)的計算公式為：

Aλmax=(A530-A700)pH=1.0-(A530-A700)pH=4.5

式中：Aλmax為最大吸收波長處的吸光值；MW為矢車菊-3-葡萄糖苷的分子質量(449.2 g/mol)；DF為待測液稀釋倍數(shù)；ε為消光系數(shù)(29 600 L/mol·cm)；l為光路長度/cm；C為花色苷質量濃度(mg/L)；V為待測液的體積/mL；M為樣品質量/g。

1.2.3.5 多糖含量測定

參考GB/T 18672—2002方法提取樣品中的多糖，采用苯酚-硫酸法測定。

1.2.3.6 總抗氧化能力測定

采用FRAP法測定，參考Xu等[12]的方法略有改動。FRAP工作液現(xiàn)用現(xiàn)配，將300 mmol/L pH3.6乙酸鈉緩沖液、10 mmol/L的TPTZ溶液(用40 mmol/L的HCl溶液配制)、20 mmol/L FeCl3·6H2O溶液按10∶1∶1比例混合得到。FRAP工作液5 mL，再加入50 μL試樣或蒸餾水，37 ℃水浴30 min，于593 nm處測定吸光值。以FeSO4·7H2O標準溶液代替樣品繪制標準曲線，樣品總抗氧化能力以FeSO4·7H2O當量計算。并以FeSO4·7H2O標準溶液代替樣品繪制標準曲線，F(xiàn)eSO4·7H2O濃度x與吸光值y之間具有高度顯著的線性關系，線性關系為y=0.000 2x-0.015 7，決定系數(shù)R2=0.997 1。

1.2.3.7 DPPH·清除率測定

參考Xu等[12]的方法略有改動。取提取液0.5 mL，加入2 mL ，2×10-4mol/L DPPH，和2.5 mL甲醇，充分混合，避光靜置30 min，517 nm測定其吸光度A1。同時測定2 mL 2×10-4mol/L DPPH·溶液與3 mL無水甲醇混合液的吸光度A2，以及0.5 mL測定液與4.5 mL無水甲醇混合液的吸光度A0，根據(jù)公式計算提取液對DPPH·的清除率：

式中：A0為提取液的本底吸光度；A1為加提取液后的吸光度；A2為未加提取液的吸光度。

1.2.3.8 ABTS+·清除率測定

取測定液0.2 mL，加入5 mL ABTS工作液，充分混合，室溫下反應10 min，于734 nm測定其吸光度A1。以無水乙醇代替測定液、ABTS工作液做空白、對照。根據(jù)公式計算測定液對ABTS+·的清除率：

式中：A0為未加ABTS工作液、提取液的本底吸光度；A1為加提取液后的吸光度；A2為未加提取液，ABTS工作液的吸光度。

1.2.3.9 ·OH清除率測定

用水楊酸捕捉羥自由基法測定。參考Li等[14]的方法略有改動。取測定液4 mL，加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4，2 mL 8 mmol/L水楊酸，最后加入2 mL 24 mmol/L H2O2啟動反應，37 ℃水浴20 min后，在510 nm測定吸光度。以蒸餾水代替H2O2作為空白，蒸餾水代替豆樣提取液作為對照。

1.2.4 超氧化物歧化酶(SOD)與過氧化物酶(POD)活性測定

稱取300 mg豆樣，按每0.1 g鮮樣加l mL 0.1 mol/L(pH 7.8)磷酸緩沖液的比例于預冷研缽中研磨成勻漿(冰浴中進行)，勻漿在冰凍離心機中(4 ℃)12 000 r/min離心20 min，取上清液置冰箱備用。

1.2.4.1 SOD活性測定

用鄰苯三酚發(fā)生自氧化法測定[15]。

式中：n為樣品稀釋倍數(shù)；V1為反應液總體積/mL；V2為測定樣品體積，mL；M為樣品鮮重。

1.2.4.2 POD活性測定

用愈創(chuàng)木酚法測定[16]。

1.2.5 胰蛋白酶抑制劑活性測定

采用趙偉偉[17]方法測定胰蛋白酶抑制劑活性。

2 結果分析

2.1 焙炒對小粒黑大豆抗氧化活性與生理活性的影響

2.1.1 焙炒對小粒黑大豆抗氧化物質的影響

焙炒處理對小粒黑大豆抗氧化物質有影響(表1)。焙炒后的小粒黑大豆的總酚、總黃酮及花色苷含量均顯著低于未處理。在210 ℃焙炒50 min，小粒黑大豆的總酚含量與未處理相當，但其總黃酮及花色苷含量顯著降低，分別保留了66.85%和7.80%。研究報道干熱熟化過程中，維生素以及一些不穩(wěn)定的抗氧化物質，例如花色苷及黃酮在高溫下發(fā)生分解，從而降低其抗氧化性[18,19]。Shahidi[20]報道大豆的酚類物質主要由酚酸組成，綠原酸、阿魏酸，咖啡酸是大豆的主要酚酸，具有很強的抗氧化性。Dewanto等[21]研究發(fā)現(xiàn)熱加工會使一些可溶性酚類物質被釋放，從而增強了物質的抗氧化活性。焙炒后小粒黑大豆的多糖含量顯著高于未處理，在210 ℃焙炒50 min，其多糖含量最高(28.36 g/100 g)。何喜珍等[22]研究發(fā)現(xiàn)，大豆多糖具有一定的抗氧化活性，且抗氧化活性與多糖濃度呈正相關。

表1 焙炒對小粒黑大豆總酚、總黃酮、花色苷及多糖含量的影響

注：表中數(shù)值為平均數(shù)±標準差(n=3)，同一列中不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)，下同。

2.1.2 焙炒對小粒黑大豆抗氧化活性的影響

焙炒后，小粒黑大豆的總抗氧化能力和對DPPH·的清除能力顯著降低，在150 ℃焙炒80 min最低(表2)。焙炒的小粒黑大豆對ABTS+·的清除能力與未處理相當，其·OH清除率較未處理顯著升高，且處理間沒有顯著差異。Jin等[23]對高蛋白大豆“Saedanbaek”品種在160、180、200 ℃烘焙10 min，其DPPH·清除率分別為54.80、60.39、72.14%，與本研究呈現(xiàn)類似的規(guī)律； Boateng等[24]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過烘焙處理后的黑豆，其DPPH·清除能力高于未處理黑豆，這可能是由于黑豆品種間差異導致抗氧化能力呈現(xiàn)出不同的規(guī)律。植物多酚酚羥基中的鄰位酚羥基極易供氫，對氧自由基具有較強的捕捉能力，表現(xiàn)出較強的羥自由基清除能力，總酚含量與羥自由基清除能力成顯著正相關[25]，表明總酚含量越高，·OH清除率越高。

表2 焙炒對小粒黑大豆總抗氧化能力、清除自由基能力的影響

2.1.3 焙炒對小粒黑大豆生理活性物質的影響

小粒黑大豆經(jīng)過焙炒后，其SOD和POD完全失活，胰蛋白酶抑制劑活性顯著降低，在210 ℃焙炒50 min，其活性降低了99.27%。

表3 焙炒對小粒黑大豆SOD與POD活性及胰蛋白酶抑制劑活性的影響

2.2 焙炒對黑豆皮抗氧化活性的影響

2.2.1 焙炒對黑豆皮抗氧化物質含量的影響

由表4可以看出，黑豆皮經(jīng)焙炒處理后，總酚、總黃酮及花色苷的含量均顯著低于未處理，在150 ℃ 25 min的處理其抗氧化物質含量最低，較原樣分別降低了32.41%、25.35%和37.82%。焙炒處理會明顯降低黑豆皮的抗氧化物質含量，但與小粒黑大豆相比，其下降幅度較小。

不同處理黑豆皮多糖含量有顯著差異(表4)。110 ℃焙炒35 min時的黑豆皮多糖含量顯著低于未處理黑豆皮(23.65%)，150 ℃焙炒25 min的黑豆皮中多糖含量明顯高于110 ℃焙炒35 min的處理。李紅等[26]報道黑豆皮的主要成分是纖維素，這與米糠的成分類似；周麟依等[27]研究發(fā)現(xiàn)米糠經(jīng)140 ℃高溫處理后，米糠中可溶性膳食纖維含量會顯著提高，同時高溫作用促使米糠中的淀粉降解成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖及麥芽糊精等低分子糖類，導致低分子糖含量增加。

表4 焙炒對黑豆皮中總酚、總黃酮、花色苷及多糖含量的影響

2.2.2 焙炒對黑豆皮抗氧化活性的影響

焙炒條件對黑豆皮抗氧化活性有顯著影響(表5)。黑豆皮經(jīng)焙炒處理后，其總抗氧化能力、ABTS+·清除率和·OH清除率顯著低于未處理，在150 ℃焙炒25 min時最低。焙炒后的黑豆皮對DPPH·的清除能力略高于未處理，但不同處理間沒有顯著差異。阿拉西等[25]認為黑豆皮的總酚含量減少，其清除·OH的能力也相對較弱，即清除·OH的能力大小與提取物總酚含量高低相一致。但是DPPH·清除能力與總酚含量沒有類似關系，DPPH·清除能力可能與黑豆皮中的抗氧化活性成分的暴露程度有關，焙炒可能引起相關清除因子的釋放，提高了其利用度。

表5 焙炒對黑豆皮總抗氧化能力、清除自由基能力的影響

3 結論

焙炒對小粒黑大豆、黑豆皮的抗氧化組分、抗氧化特性以及生物特性有顯著影響。焙炒會導致小粒黑大豆的總酚、總黃酮及花色苷含量以及總抗氧化能力顯著降低，SOD、POD及胰蛋白酶抑制劑失活。與210 ℃、50 min焙炒條件相比，在150 ℃下焙炒80 min，小粒黑大豆的總酚、總黃酮、花色苷及總抗氧化能力有較高保留，ABTS+·清除率、·OH清除率較高，多糖含量顯著高于原樣；其次，210 ℃焙炒的黑豆有焦糊味，會產(chǎn)生對人體有害的美拉德反應產(chǎn)物，且高溫焙炒也會提高加工成本。因此小粒黑大豆在150 ℃焙炒80 min可較好地保留抗氧化性。經(jīng)焙炒處理，黑豆皮的總酚、總黃酮及花色苷含量以及總抗氧化能力顯著降低。相比150 ℃焙炒25 min，黑豆皮在110 ℃下焙炒35 min，其總酚、總黃酮和花色苷均有較高保留，其總抗氧化能力、ABTS+·清除率、·OH清除率和DPPH·清除率均較強，多糖含量保留了64.14%，同時胰蛋白酶抑制劑幾乎完全失活。因此黑豆皮在110 ℃焙炒35 min可較好保留抗氧化性。