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TRPV4抑制劑對脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用

2019-07-16 11:49:54鐘景良姚慧文林錦鋒梁錦堂李姝君
國際呼吸雜志 2019年13期
關(guān)鍵詞:洗液肺泡抑制劑

鐘景良 姚慧文 林錦鋒 梁錦堂 李姝君

1江門市新會(huì)區(qū)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科529100;2廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤一區(qū),湛江524001

ARDS在重癥醫(yī)學(xué)科及呼吸危重癥中臨床病死率高達(dá)35%~45%,其早期階段主要表現(xiàn)為急性肺損傷 (acute lung injury,ALI)。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是ALI的常見誘發(fā)因素,常用于誘導(dǎo)ALI模型的建立。因此,如果能在早期階段有效地干預(yù)ALI,延緩或阻斷其發(fā)展為ARDS,從而為患者爭取更多的治療時(shí)間,具有重大的臨床意義。瞬時(shí)感受器電位香草酸受體4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)是瞬時(shí)感受器電位超家族中的一個(gè)離子通道,它可以感受內(nèi)源性和外源性的刺激,并參與疾病的病理生理過程。近年來陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道,其在肺部疾病,如屋塵螨誘導(dǎo)的哮喘模型[1]、酸誘導(dǎo)的ALI模型[2]中扮演著重要角色。另外有文獻(xiàn)報(bào)道,TRPV4在LPS誘導(dǎo)人類氣道上皮細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的過程中起著重要作用[3]。但其在LPS誘導(dǎo)的ALI病理生理中的調(diào)節(jié)作用目前尚不明確。因此,本研究使用TRPV4特異性抑制劑作用于LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型,探討其在LPS致ALI中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6~8周雌性SPF級BALB/c小鼠40只,體質(zhì)量20~30 g,購于廣東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 LPS(Sigma,美國),GSK2193874(TRPV4選擇性抑制劑,Selleck.cn,美國),小鼠IL-1β、IL-18、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑盒 (eBioscience,美國),兔抗TRPV4多克隆抗體 (Cell Signaling Tech,美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試劑配制 GSK2193874溶于含有2%DMSO的PBS緩沖液,按每只小鼠單位體質(zhì)量5 mg/kg劑量配制成濃度為0.5 g/L GSK2193874溶液,同時(shí)配制含有2%DMSO的PBS溶液及LPS溶液待用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組和動(dòng)物模型 采用隨機(jī)分配的方法將40只小鼠分為4組,每組10只,分別為對照組、LPS 組、LPS+GSK2193874 組、LPS+DMSO組。各組小鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨后LPS+GSK2193874組、LPS+DMSO組在建模前3 d分別采用GSK2193874(0.5 mg/ml,250μl)、2%DMSO(250μl)進(jìn)行腹腔注射 (1次/d,連續(xù)3 d)。第4天所有小鼠進(jìn)行一次性腹腔注射LPS(5 mg/kg)建立ALI模型。各組小鼠在建模6 h后,使用1%戊巴比妥鈉麻醉后留取標(biāo)本。

1.3.3 肺泡灌洗液測定 小鼠行氣管插管后,使用0.9%氯化鈉溶液0.8 ml進(jìn)行肺泡灌洗,反復(fù)2次?;厥蘸?,4℃,離心半徑10 cm,800 r/min離心5 min,留取上清液置于-80℃冰箱中待測。

1.3.4 肺濕/干重比值測定 取小鼠右肺下葉用濾紙吸干表面水分,稱取濕重。恒溫箱中 (60℃,48 h)烘干至恒重后稱取干重,再計(jì)算濕/干重比值。

1.3.5 病理HE染色 留取小鼠左肺于4%多聚甲醛固定后,常規(guī)脫水包埋后切片,制成石蠟切片備用??酒筮M(jìn)行二甲苯、梯度酒精脫蠟;依次使用蘇木素、伊紅染液進(jìn)行染色,封片后鏡下觀察病理情況。

1.3.6 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片烤片3 h,常規(guī)二甲苯、梯度酒精脫蠟。3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化氫酶,在95~99℃下水浴抗原修復(fù),恢復(fù)至室溫后,使用BSA封閉20 min,滴加TRPV4抗體后4℃孵育過夜,PBS洗滌,加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗工作液室溫孵育40 min,PBS洗滌,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,梯度乙醇脫水,中性樹膠封片,出現(xiàn)棕黃色顆粒者判定為TRPV4陽性。

1.3.7 蛋白印跡法 肺組織采用RIPA(碧云天生物技術(shù)有限公司)充分勻漿裂解,離心半徑10 cm,10 000 r/min離心30 min后,BCA法進(jìn)行總蛋白濃度測定,其余上清加緩沖液后100℃煮沸變性。取20μg總蛋白用SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜后,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,特異性一抗4℃孵育過夜。次日用TBST洗3次后,室溫孵育二抗2 h,清洗未結(jié)合抗體后,用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白含量,條帶使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3.8 肺組織細(xì)胞因子測定 小鼠右肺上葉經(jīng)組織勻漿后,4℃,離心半徑10 cm,13 000 r/min離心15 min,收集上清,嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒說明書進(jìn)行IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α蛋白含量的測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用 Graphpad Prism 6.0及 Adobe Illustrator CS6進(jìn)行圖形制作。所有數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較使用單因素方差分析,2組間比較使用LSD-t方法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織中TRPV4的表達(dá) 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,LPS組小鼠肺組織中TRPV4表達(dá)較對照組增多,TRPV4主要表達(dá)于氣道周圍浸潤的炎癥細(xì)胞,同時(shí)肺泡上皮及氣道上皮細(xì)胞也有表達(dá),使用TRPV4抑制劑后TRPV4表達(dá)明顯減少 (圖1)。蛋白印跡法檢測各組小鼠肺組織中TRPV4的表達(dá),結(jié)果顯示,LPS組小鼠肺組織中TRPV4蛋白相對表達(dá)量較對照組增多 (圖2)。提示TRPV4可能在小鼠ALI的發(fā)生、發(fā)展中起作用。

圖1 各組小鼠肺組織中TRPV4的表達(dá) (n=10) A:對照組;B:LPS組;C:LPS+GSK2193874組;D:LPS+DMSO組 免疫組織化學(xué) ×400

圖2 蛋白印跡法檢測各組小鼠肺組織中TRPV4的表達(dá)(n=6) A:電泳圖;B:柱狀圖

2.2 各組小鼠肺濕/干重比值及肺泡灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù) 結(jié)果顯示,TRPV4抑制劑可以減輕ALI小鼠肺濕/干重比值 (圖3),減少肺泡灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù) (圖4)。

圖3 各組小鼠肺濕/干重比值

圖4 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)

2.3 各組小鼠氣道及肺組織炎癥表現(xiàn) 結(jié)果顯示,LPS組小鼠氣道周圍炎癥明顯加重,肺泡組織破壞增多,伴有氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤,氣道上皮細(xì)胞增生明顯;而使用GSK2193874干預(yù)后的ALI小鼠氣道周圍及肺組織炎癥明顯減輕 (圖5)。

2.4 各組小鼠肺泡灌洗液和肺組織中炎癥因子表達(dá) 結(jié)果顯示,與對照組比較,LPS組小鼠肺泡灌洗液和肺組織中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子升高(P值均<0.05);使用GSK2193874干預(yù)后,小鼠肺泡灌洗液和肺組織中細(xì)胞因子水平有所下降 (P值均<0.05)。見圖6、7。

圖5 各組小鼠氣道周圍及肺組織炎癥表現(xiàn) HE ×100 A:對照組;B:LPS組;C:LPS+GSK2193874組;D:LPS+DMSO組

圖6 各組小鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞因子的比較

圖7 各組小鼠肺組織中細(xì)胞因子的比較

3 討論

ALI是ARDS的早期階段,是目前呼吸危重癥患者的主要死因之一。造成ALI的主要原因是革蘭陰性菌感染,其釋放的大量LPS是ALI發(fā)生、發(fā)展的主要因素。TRPV4是瞬時(shí)感受器電位超家族重要的一員,近10年來,其被證實(shí)廣泛存在于血管平滑肌、內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞及支氣管中,且在肺部疾病的病理生理機(jī)制中扮演著重要角色[4-5]。此外,近來也有不少文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)TRPV4在咳嗽、哮喘、肺纖維化及心力衰竭引起的肺水腫的病理生理中發(fā)揮著重要作用[6-8]。

作為信號集成器,TRPV4可通過鈣離子觸發(fā)電壓門控離子通道的開放,從而引發(fā)大量的細(xì)胞內(nèi)事件,最終引起特定的組織反應(yīng)[9]。最新文獻(xiàn)也發(fā)現(xiàn)TRPV4可以通過介導(dǎo)氣道上皮黏附分子的功能障礙調(diào)控中性粒細(xì)胞性炎癥[10]。本研究中,LPS暴露后小鼠肺組織切片病理可見大量中性粒細(xì)胞浸潤,肺泡上皮細(xì)胞受損,可見黏液滲出,證明復(fù)制模型成功。隨后,使用免疫組織化學(xué)方法檢測ALI小鼠模型中肺組織TRPV4表達(dá)明顯增高,提示TRPV4在ALI的發(fā)生、發(fā)展中可能扮演著重要角色。肺水腫及大量炎癥滲出是ALI/ARDS的主要病理生理特征之一。既往研究表明,阻斷TRPV4信號可減少鈣離子內(nèi)流,減輕肺水腫程度[6]。此外,也有TRPV4抑制劑已經(jīng)應(yīng)用于臨床上心力衰竭的治療[4,11]。本研究中,與LPS組及LPS+DMSO組相比,注射TRPV4特異性抑制劑GSK2193874的小鼠,其炎癥指標(biāo)、肺濕/干重比值及中性粒細(xì)胞浸潤減少,提示作用于TRPV4通路可能抑制ALI/ARDS的發(fā)生、發(fā)展。這與既往研究結(jié)論[1-2,12]基本一致。

全身性炎癥反應(yīng)是ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制之一[13]。同時(shí),本研究對肺組織和肺泡灌洗液中ALI/ARDS經(jīng)典的炎癥細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示無論肺組織還是肺泡灌洗液中ALI小鼠IL-1β、TNF-α、IL-6明顯升高,而使用TRPV4抑制劑后,各炎癥因子水平可下降。IL-1β、TNF-α可以誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生,使中性粒細(xì)胞聚集并黏附于內(nèi)皮細(xì)胞,破壞內(nèi)皮及上皮通透性,從而促進(jìn)肺水腫發(fā)生[14-15]。IL-6是促進(jìn)中性粒細(xì)胞炎癥的經(jīng)典趨化因子,而ALI/ARDS以大量中性粒細(xì)胞浸潤為主,因此IL-6可促進(jìn)ALI/ARDS的發(fā)生、發(fā)展。TRPV4抑制劑可以使各細(xì)胞因子降低,從而減輕ALI/ARDS炎癥。同時(shí)檢測IL-18的水平,發(fā)現(xiàn)IL-18亦有相同趨勢。IL-18、IL-1β是炎癥體及caspase-1經(jīng)典下游分子,GSK2193874可使其水平降低,筆者推測其可能通過抑制炎癥小體通路而起作用,具體機(jī)制尚需要繼續(xù)深入探討。綜上所述,本研究結(jié)果表明,阻斷TRPV4信號可以減輕ALI/ARDS炎癥水平,TRPV4未來可能成為ALI治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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