許愛珍，李 歡，張 宏，張 悅，石貴榮#，安 明，張耀升，郭曉文

(1.包頭市中心醫(yī)院制劑科，內(nèi)蒙古 包頭 014040； 2.包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

痹通沖劑(批準(zhǔn)文號(hào)：內(nèi)藥制字Z17020006)是包頭市中心醫(yī)院制劑科根據(jù)中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論及經(jīng)驗(yàn)方制定的協(xié)定處方，已應(yīng)用于臨床多年，療效確切。該藥由紅花、葛根及伸筋草等18味中藥加工精制而成，臨床主要用于治療頸椎病、神經(jīng)根痛、四肢麻木和肢體活動(dòng)受限。羥基紅花黃色素A是紅花中最具藥理活性的水溶性成分，是《中華人民共和國藥典》(2015年版)收錄紅花藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)成分之一[1-2]。高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定紅花中羥基紅花黃色素A，具有操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好和專屬性強(qiáng)等特點(diǎn)[3]。既往研究采用HPLC法測(cè)定蒙藥制劑其格日木湯[4]、二十五味大湯膠囊[5]、紅花跌打膠囊[6]、參麥散結(jié)膠囊[7]、醋制消腫止痛液[8]、麝香接骨丸[9]和舒心寧片[10]中的羥基紅花黃色素A含量，取得了較好結(jié)果。葛根素是豆科植物葛根中的異黃酮類化合物[11]，許多葛根及其制劑常選用葛根素的含量作為其質(zhì)量控制指標(biāo)[12]。既往研究采用HPLC法測(cè)定鐵必復(fù)顆粒[13]、金蓮花湯[14]、回神顆粒[15]和益氣活血通絡(luò)顆粒[16]中的葛根素含量，取得了較好結(jié)果。為了有效控制痹通沖劑的質(zhì)量，本研究建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定其中羥基紅花黃色素A、葛根素2種成分含量的方法。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000型高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器(賽默飛世爾科技有限公司)；Sartorius BSA2245S-CW型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；AS2060B型超聲波清洗儀(北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司)。

1.2 藥品與試劑

羥基紅花黃色素A對(duì)照品(內(nèi)蒙古伏安瓦科技有限公司，批號(hào)：180323-0179)；葛根素對(duì)照品(中國食品藥品研究院，批號(hào)：110752-201514)；痹通沖劑(規(guī)格：7 g×9袋，包頭市中心醫(yī)院，批號(hào)：20150506、20150508及20150509)；乙腈為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液：分別精密稱取羥基紅花黃色素A、葛根素對(duì)照品19.45、23.30 mg，分別制成質(zhì)量濃度為0.972 5、1.165 0 mg/ml的對(duì)照品貯備液。分別精密移取上述對(duì)照品貯備液1.0 ml置于10 ml容量瓶中，用40%乙醇稀釋至刻度，即得混合對(duì)照品溶液，其中羥基紅花黃色素A、葛根素對(duì)照品的質(zhì)量濃度分別為97.25、116.5 μg/ml。

2.1.2 供試品溶液：取本品研細(xì)，精密稱取約1.55 g，置于具塞錐形瓶中，精密移取40%乙醇溶液50 ml，稱質(zhì)量，超聲(功率0.1 kVA,頻率40 kHz)提取40 min，放冷，用40%甲醇補(bǔ)足減少的質(zhì)量，濾過，續(xù)濾液用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 陰性對(duì)照品溶液：根據(jù)痹通沖劑處方和制法，制成不含紅花、葛根的陰性對(duì)照品。精密稱取陰性對(duì)照品約1.55 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱采用安捷倫C18柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)和 0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫；流速為1.0 ml/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μl。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elute

2.3 專屬性考察

分別取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，供試品溶液色譜圖中，有與混合對(duì)照品溶液保留時(shí)間一致的色譜峰，且理論板數(shù)和分離度均較好，而陰性對(duì)照品溶液色譜峰在對(duì)應(yīng)保留時(shí)間上無色譜峰干擾，見圖1。

A.混合對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對(duì)照溶液；組分1：羥基紅花黃色素A；組分2：葛根素A. mixed standard solution; B. sample solution; C. negative control solution；constituent 1：hydroxysafflor yellow A; constituent 2：puerarin圖1 HPLC圖Fig 1 HPLC chromatogram

2.4 線性關(guān)系考察

吸取混合對(duì)照品溶液2、4、6、8及10 μl分別進(jìn)樣，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，記錄峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)(r)，見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 2 Linear relationship

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μl，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件平行測(cè)定6次，記錄2種有效成分的峰面積。羥基紅花黃色素A、葛根素峰面積的RSD分別為0.66%、0.57%，表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)痹通沖劑樣品(批號(hào)：20150506)研細(xì)，取約1.55 g，共5份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，并按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄2種有效成分的峰面積。羥基紅花黃色素A、葛根素峰面積的RSD分別為1.83%、1.12%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別放置0、2、4、6、8、10、12及24 h時(shí)進(jìn)樣10 μl，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄2種有效成分的峰面積。羥基紅花黃色素A、葛根素峰面積的RSD分別為1.57%、1.02%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的痹通沖劑樣品(批號(hào)：20150506)9份，每份約0.78 g，精密稱定，分別精密加入2種有效成分對(duì)照品溶液適量。按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄2種有效成分的峰面積，并分別計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Recovery test results

2.9 樣品含量測(cè)定

取樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下制成供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并進(jìn)行分析，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中葛根素及羥基紅花黃色素A的含量，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)痹通沖劑中的待測(cè)成分羥基紅花黃色素A、葛根素在DAD檢測(cè)器下進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果各成分在253 nm處均有較大吸收，且該波長(zhǎng)處待測(cè)成分無干擾。因此，選用253 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 提取方式的選擇

考察了超聲和回流2種提取方式，發(fā)現(xiàn)兩者的提取效率差異不大。而超聲提取法更加簡(jiǎn)便、節(jié)能，故選擇超聲法提取。采取20%乙醇、40%乙醇和60%乙醇進(jìn)行超聲處理，結(jié)果顯示，40%乙醇的提取效果最佳。對(duì)不同超聲時(shí)間20、30、40和50 min中所提取2種成分的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，樣品中葛根素和羥基紅花黃色素A在40 min提取完全，故最后提取時(shí)間為40 min。

3.3 流動(dòng)相的選擇

考察了多個(gè)流動(dòng)相體系，包括乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水及乙腈-0.1%磷酸水溶液，進(jìn)行等度或梯度洗脫，其中乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫的效果最好，色譜圖中各成分的峰形和分離度最佳。

表4 含量測(cè)定結(jié)果
Tab 4 Content determination results

成分質(zhì)量濃度/(μg/ml)峰面積平均質(zhì)量濃度/(μg/ml)平均峰面積含量/(mg/g)平均含量/(mg/g)RSD/%羥基紅花黃色素A26.367 22.792 826.397 92.777 10.848 80.858 61.5426.428 52.761 426.505 22.870 026.438 32.862 90.849 826.371 42.855 726.320 62.850 326.062 02.822 90.837 825.803 32.795 426.770 82.955 026.815 72.931 40.861 926.860 62.907 726.886 82.910 526.863 22.908 00.863 326.839 52.905 527.080 52.931 127.192 92.914 70.874 027.305 32.898 226.604 32.779 026.810 72.771 40.861 927.017 12.763 826.510 62.870 526.463 32.865 50.850 626.416 02.860 527.386 82.963 727.372 92.962 20.879 727.358 92.960 7葛根素44.504 832.063 844.570 931.913 61.433 11.460 51.3344.636 931.763 344.966 833.050 944.877 032.985 81.442 544.787 232.920 745.068 233.124 444.724 932.875 51.437 744.381 532.626 546.380 634.076 146.152 433.910 61.483 345.924 133.745 145.800 933.655 745.773 333.635 71.471 045.745 733.615 746.304 034.020 546.127 833.892 81.482 545.951 533.765 045.179 732.149 945.513 632.038 71.463 145.847 431.927 545.406 333.369 645.255 533.260 31.454 645.104 633.150 945.932 933.751 545.950 833.764 51.476 845.968 733.777 4