4 李?？?王保民 仲格嘉

(1.中國(guó)藏學(xué)研究中心 藏醫(yī)藥研究所， 北京 100094; 2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 資源信息研究所，北京 100091;3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 北京 100193； 4.世紀(jì)神農(nóng)(北京)國(guó)際生物技術(shù)公司， 北京 100073)

藏藥波棱瓜(Herpetospermumpedunculosum(Ser.) Baill.)，又名色吉美朵、塞季美朵、塞美塞古，屬葫蘆科波棱瓜屬一年生攀援藤本植物，自然分布于中國(guó)西藏、云南、四川等地及印度、尼泊爾等國(guó)，在西藏主要分布于藏東南地區(qū)海拔2 300～3 500 m的山坡林緣，以種子入藥[1-3]；味苦，可清熱解毒，護(hù)肝，治黃疸性傳染性肝炎、消化不良等癥[1-4,8]。波棱瓜子是藏醫(yī)治療肝病的常用、高頻藏藥材[5]，是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)品種。研究發(fā)現(xiàn)，波棱瓜子治療肝炎、肝纖維化的作用機(jī)制包括調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路[6]和改善能量代謝、雙向調(diào)節(jié)支鏈氨基酸等[7]。該藥材近年來市場(chǎng)需求逐漸加大，但受藏區(qū)特殊地理氣候條件所限和人為因素影響，野生資源日益減少。該物種為雌雄異株，自然條件下其雌雄比嚴(yán)重失調(diào)，雌株比例顯著少于雄株，掛果率較低；自然生長(zhǎng)的路旁、林緣地帶，由于近年來交通建設(shè)和掠奪式采收等人為因素影響，目前瀕于滅絕。西藏地區(qū)栽培技術(shù)缺乏，大面積人工栽培很少。波棱瓜子嚴(yán)重短缺，制約了藏醫(yī)藥事業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，對(duì)高原生物多樣性的恢復(fù)也帶來負(fù)面影響。

目前，波棱瓜的人工栽培技術(shù)研究還只是停留在簡(jiǎn)單、粗放的人工引種試驗(yàn)，產(chǎn)量較低，推廣困難；波棱瓜種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究較少，種子質(zhì)量、產(chǎn)量形成的相關(guān)因子缺乏系統(tǒng)研究；波棱瓜花果期較長(zhǎng)，種子成熟期不一致，造成了種子質(zhì)量不均一，發(fā)芽和出苗不整齊，從而影響其產(chǎn)量和質(zhì)量。研究波棱瓜種子品質(zhì)和產(chǎn)量形成的相關(guān)因子對(duì)提高波棱瓜生產(chǎn)水平有重要意義。

1 材 料

以中國(guó)藏學(xué)研究中心藏醫(yī)藥研究所從西藏采集的野生波棱瓜種子為試驗(yàn)材料。經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所鑒定，為葫蘆科植物波棱瓜(Herpetospermumpedunculosum(Ser.) Baill.)的種子。

2 方 法

2.1田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)地設(shè)在西藏林芝市八一鎮(zhèn)核桃村，尼洋河畔，中國(guó)藏學(xué)研究中心藏藥研究基地。海拔2 900 m。本試驗(yàn)地選擇在地勢(shì)高崗、沙質(zhì)土壤的向陽(yáng)地塊。土壤pH值為6.5。每667 m2施腐熟有機(jī)肥2 500 kg做底肥。對(duì)種植地翻耕、平整、灌溉。整理為0.8 m寬的高畦，溝寬0.3 m。播種方法：穴播，每穴播種7粒，澆水，覆土2～3 cm。畦面覆蓋地膜。按不同催芽方法、不同播期、不同密度、不同施肥方案設(shè)置波棱瓜種植試驗(yàn)小區(qū)。每個(gè)小區(qū)12 m2(2 m ×6 m)，小區(qū)間的隔離帶為1.0 m。試驗(yàn)采取隨機(jī)排列，重復(fù)3次。

2.2試驗(yàn)項(xiàng)目

2.2.1催芽方法試驗(yàn)

對(duì)照組為直播；45 ℃溫水浸種48 h；催芽劑青霉素200 mg· L-1、赤霉素200 mg· L-1、ABT 6號(hào)生根粉(GGR 6)200 mg· L-1，分別浸種12 h后，以自來水沖洗2次。其中青霉素采用華北制藥股份有限公司生產(chǎn)的青霉素鉀粉劑,含量99%;赤霉素采用廣州市林國(guó)化肥有限公司生產(chǎn)的赤霉素920(GA3),含量90%; ABT 6號(hào)生根粉(GGR 6)由北京艾比蒂生物科技有限公司生產(chǎn), GGR 6含量99%。

2.2.2播期試驗(yàn)

種子處理均采用45 ℃溫水浸種48 h法。分別于2016年4月13日，5月10日，6月10日播種，對(duì)比試驗(yàn)。

2.2.3密度試驗(yàn)

分別采用穴距35 cm×70 cm，50 cm×70 cm 和 70 cm ×70 cm不同密度對(duì)比試驗(yàn)。

2.2.4施肥方案試驗(yàn)

復(fù)合肥施肥量45 g·m-2、EM益生菌肥葉面噴施濃度2 000 mg· L-1、 追施磷肥45 g·m-23種不同施肥方案對(duì)比試驗(yàn)。復(fù)合肥(N∶P∶K=18∶12∶5)，總含量35%；EM益生菌由河北滄州旺發(fā)生物技術(shù)研究所生產(chǎn)，含量90%；磷肥(過磷酸鈣)由濟(jì)南清?；び邢薰旧a(chǎn)，P2O5含量12 %。

2.3品質(zhì)和產(chǎn)量測(cè)定

分別于7月—10月份果實(shí)成熟期(以果實(shí)開始變黃褐色、開始裂口為標(biāo)準(zhǔn))陸續(xù)采收果實(shí)，自然陰干脫粒、凈化。分別測(cè)定種子千粒重、單株種子產(chǎn)量和單位面積種子產(chǎn)量。

2.4有效成分測(cè)定

定性測(cè)定采用薄層色譜法。定量采用高效液相色譜法[9]，測(cè)定波棱瓜總木脂素、波棱醇(herpetrione)、波棱素(herpetin)的含量。

2.5數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步計(jì)算，采用SPSS 軟件進(jìn)行處理，單因素方差分析，Duncan 法進(jìn)行多重比較(α=0.05)。

3 結(jié)果與分析

3.1不同催芽方法對(duì)出苗率及種子品質(zhì)和產(chǎn)量的影響

本試驗(yàn)中，對(duì)照(ck)：直播；C 1：45 ℃溫水浸種；C 2：青霉素催芽；C 3：赤霉素催芽；C 4:ABT 6號(hào)生根粉(GGR 6)催芽。共5個(gè)處理，重復(fù)3次。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 不同催芽方法對(duì)出苗率及種子品質(zhì)和產(chǎn)量的影響

催芽方法出苗率/%種子千粒重/g單株產(chǎn)量/(g·株-1)單位面積產(chǎn)量/(g·m-2)ck15.50e56.40e35.04e69.34eC121.67d56.91c36.17d69.70dC232.83b56.73d36.98b72.38bC326.43c57.13b36.60c70.21cC435.83a57.52a37.26a75.18a

注：同一指標(biāo)不同字母者表示差異顯著(p<0.05)。下同。

試驗(yàn)結(jié)果表明，上述催芽方法均可顯著提高波棱瓜種子的大田出苗率，其中以ABT生根粉(GGR 6)和青霉素催芽的效果最好，赤霉素和溫水浸種效果次之；不同催芽方法與對(duì)照相比，均可顯著提高種子千粒重，各種催芽方法之間均差異顯著，其中ABT生根粉(GGR 6)催芽方法效果最好，依次為赤霉素催芽、溫水浸種和青霉素催芽；單株產(chǎn)量方面，各種催芽方法之間亦均差異顯著，經(jīng)ABT生根粉(GGR 6)處理的單產(chǎn)最高，較對(duì)照組提高6.34%，然后依次為青霉素催芽、赤霉素催芽和溫水浸種；單位面積產(chǎn)量方面，以ABT生根粉(GGR 6)效果最好，比對(duì)照組提高8.22%，然后依次為青霉素、赤霉素、溫水浸種。

3.2不同播期對(duì)種子品質(zhì)和產(chǎn)量的影響

本試驗(yàn)中，不同播期分別設(shè)置為，P 1:4月13日，P 2:5月10日,P 3:6月10日。3個(gè)處理，重復(fù)3次。結(jié)果見表2。

表2 不同播期對(duì)種子品質(zhì)和產(chǎn)量的影響

播期種子千粒重/g單株產(chǎn)量/(g·株-1)單位面積產(chǎn)量/(g·m-2)P154.44c36.33a37.50cP262.25a36.05ab48.24bP357.53b35.44b57.35a

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用不同播期收獲的波棱瓜，其種子千粒重之間差異顯著，其中4月播期所收獲的種子千粒重最低，5月播期的種子千粒重最高；4月和6月播期的單株產(chǎn)量有顯著差異，4月和5月，5月和6月播期之間差異不明顯；不同播期之間單位面積產(chǎn)量差異明顯，其中6月播期的單位面積產(chǎn)量最高，4月播期的單位面積產(chǎn)量最低。

3.3不同密度對(duì)種子品質(zhì)和產(chǎn)量的影響

本試驗(yàn)分別按不同穴距設(shè)置試驗(yàn)。分別為D 1：35 cm×70 cm,D 2:50 cm×70 cm,D 3:70 cm×70 cm。3次重復(fù)。結(jié)果見表3。

表3 不同密度對(duì)種子品質(zhì)和產(chǎn)量的影響

密度種子千粒重/g單株產(chǎn)量/(g·株-1)單位面積產(chǎn)量/(g·m-2)D154.79a36.35a69.78aD254.28b36.11b67.35bD354.21b36.06b40.85c

本試驗(yàn)中：雌株占比16%～20%，平均雌株比18.87%。試驗(yàn)結(jié)果表明，穴距35 cm×70 cm處理的種子千粒重、單株產(chǎn)量、單位面積產(chǎn)量均高于穴距50 cm×70 cm處理，方差分析結(jié)果雖兩者差異顯著，但僅分別高出0.39%、0.66%和3.61%。穴距70 cm×70 cm 與50 cm×70 cm 處理之間的種子千粒重和單株產(chǎn)量均無顯著差異，穴距70 cm×70 cm 的單位面積產(chǎn)量顯著低于另外2組。

3.4不同施肥方案對(duì)種子質(zhì)量和產(chǎn)量的影響

本試驗(yàn)中，對(duì)照(ck)：常規(guī)施肥； F 1：EM益生菌肥葉面噴施；F 2：追施磷肥。共3個(gè)處理，3次重復(fù)。結(jié)果見表4。

表4不同施肥方案對(duì)種子品質(zhì)和產(chǎn)量的影響

施肥方案種子千粒重/g單株產(chǎn)量/(g·株-1)單位面積產(chǎn)量/(g·m-2)ck57.34c35.05c75.20cF170.71a36.40b85.66bF269.43b43.39a87.57a

試驗(yàn)結(jié)果表明，EM益生菌肥和追施磷肥均可顯著提高波棱瓜種子千粒重、單株產(chǎn)量和單位面積產(chǎn)量；種子千粒重指標(biāo)上，EM益生菌肥處理組比對(duì)照組提高23.32%,比追施磷肥高1.84%；而磷肥對(duì)波棱瓜單株產(chǎn)量和單位面積產(chǎn)量的貢獻(xiàn)值較大，分別比對(duì)照提高23.79%和16.45%,比EM益生菌肥處理高19.20%和2.23%。

3.5種子有效成分測(cè)定

對(duì)不同措施條件下采收的各批次波棱瓜種子分別進(jìn)行定性檢驗(yàn)和有效成分定量檢測(cè)。定性檢驗(yàn)結(jié)果均符合藏藥材部頒標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。采用高效液相色譜法測(cè)得各批次種子中的有效成分總木脂素含量均在0.52%～0.86%之間，其中波棱醇含量在0.26%以上，波棱素含量均在0.19%以上。人工栽培波棱瓜的種子可以作為藏藥材使用。

4 討論與結(jié)論

4.1波棱瓜種子有一定程度的休眠特性，在自然條件下，出苗率較低且不整齊。種子休眠是植物在系統(tǒng)發(fā)育過程中長(zhǎng)期自然選擇的結(jié)果，是抵御外界不良環(huán)境、調(diào)節(jié)萌發(fā)最佳時(shí)間和空間分布的一種機(jī)制。波棱瓜與其它有休眠特性的植物一樣，有本身適應(yīng)環(huán)境和延續(xù)生存的需要，或由內(nèi)在生理因素(種皮厚，對(duì)水、氣的不透性；胚發(fā)育未完成、生理上未成熟、缺少必需的激素或存在抑制萌發(fā)的物質(zhì)等原因)造成[10-11]；或由于溫度、濕度、空氣等環(huán)境因素達(dá)不到種子萌發(fā)要求。本研究通過對(duì)波棱瓜種子催芽方法的篩選試驗(yàn)，優(yōu)選出2種效果較好的催芽劑：其中青霉素可顯著促進(jìn)波棱瓜種子萌發(fā)，與王宏霞等[12]的研究結(jié)論基本一致，比對(duì)照組出苗率提高111.81%；ABT 6號(hào)生根粉可使波棱瓜種子出苗率提高131.16%。其機(jī)理可能是由于該2種催芽劑改變了種子內(nèi)的激素比例，促使原本處于休眠狀態(tài)的種胚激活，使其恢復(fù)了伸長(zhǎng)生長(zhǎng)能力，促使種子萌發(fā)。

4.2關(guān)于種植密度與雌雄株調(diào)控：密度試驗(yàn)中，密度較大的穴距35 cm×70 cm處理組的種子千粒重、單株產(chǎn)量均顯著高于密度較小的穴距50 cm×70 cm處理組。這種現(xiàn)象可能是由于波棱瓜為雌雄異株，雌株比例較低(16%～20%)，隨機(jī)分布不均的原因所造成。今后應(yīng)在研究提高雌株比的途徑和方法、篩選雌雄調(diào)節(jié)劑、輔以早期雌雄株識(shí)別技術(shù)進(jìn)而人工調(diào)控的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展栽培密度試驗(yàn)，確定合理密度，以提高波棱瓜種子產(chǎn)量。

4.3本研究發(fā)現(xiàn),播種期為4月的波棱瓜，所產(chǎn)種子千粒重和產(chǎn)量均顯著低于5月和6月播種的波棱瓜，可能與早期營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過旺，進(jìn)入花果期后營(yíng)養(yǎng)供給不足有關(guān)；4月播期的波棱瓜產(chǎn)量較低，與該期雌株分化比例較小有關(guān)：林芝地區(qū)春季較為干燥，地溫回升慢，而5月—6月播種的波棱瓜在性別分化期處于溫度、濕度、光照較好的環(huán)境下，自然界雌雄異株植物性別分化的常見模式表現(xiàn)為，有利植物生長(zhǎng)環(huán)境下向雌性分化，逆境條件下向雄性分化，因而5月—6月播種的波棱瓜中雌株比例較高。這與關(guān)法春等[13]、Correial O[14]和EI-keblawy A[15]等對(duì)其他雌雄異株植物相關(guān)研究得到的結(jié)論基本一致。因此，波棱瓜在西藏林芝地區(qū)的適宜播種期應(yīng)為5月—6月，不宜早播。

4.4通過試驗(yàn)研究，初步取得了野生波棱瓜人工栽培成功，波棱瓜子品質(zhì)符合國(guó)家藏藥材標(biāo)準(zhǔn)要求。篩選出的催芽方法、播期、施肥方案為今后制定波棱瓜子標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)操作規(guī)程(SOP)提供了科學(xué)依據(jù)，對(duì)指導(dǎo)藏區(qū)波棱瓜的人工栽培和種子生產(chǎn)有重要意義。