羅阿東 陸鄒紅 蔡秋

摘要? ? 采用CTAB法、SDS法、吸附柱法對辣椒及其制品中的基因組DNA進(jìn)行提取，分別通過核酸蛋白測定儀、瓊脂糖凝膠電泳、實時熒光PCR擴(kuò)增檢測。結(jié)果表明，CTAB法、SDS法、吸附柱法均能從鮮辣椒、干辣椒、油辣椒、辣椒醬中抽提得到DNA，從核酸蛋白測定儀檢測得到的DNA提取物OD260/OD280值可看出，CTAB法和SDS法提取的DNA純度較吸附柱法的低;DNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，各樣品均無大范圍明顯拖尾，說明DNA提取完整度較好;實時熒光PCR檢測分析3種提取方法的不同樣品基因組DNA均出現(xiàn)PCR擴(kuò)增曲線。經(jīng)試驗比較確定，提取方法的效率由高到低依次為吸附柱法>SDS法>CTAB法?？梢?，吸附柱法最適用于辣椒及其制品中核酸提取。

關(guān)鍵詞? ? 辣椒及其制品;DNA提取;CTAB法;SDS法;DNA吸附柱

中圖分類號? ? S641.3? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? ? A? ? ? ? 文章編號? ?1007-5739（2019）01-0212-02

Abstract? ? CTAB，SDS and DNA adsorption column method were adopted to extract DNA from chilli and its products.Nucleic acidprotein detector method，agarose gel electrophoresis method and real-time fluorescence PCR amplification methods were applied to measure the DNA samples.The results showed that DNA could be extracted by CTAB，SDS and adsorption column from chilli and its products.It could be seen from the OD260/OD280 value of DNA extract by nucleic acid protein detector，the concentration of DNA extracted by CTAB and SDS was lower than that by adsorption column.Agarose gel electrophoresis measurement showed DNA extracted with 3 methods? there was no obvious tail smearing in all areas，the results showed that DNA had better extraction integrity.The PCR amplification curve of genomic DNA of 3 different extraction methods was detected by real-time fluor-escence PCR.Through experiment and comparison，it was determined that the efficiency of the extraction method was as following：adsorption column method>SDS method>CTAB method.In summary，the adsorption column method is the most suitable for extracting nucleic acid from chilli and its products.

Key words? ? chilli and its products;DNA extraction;CTAB method;SDS method;DNA adsorption column

辣椒是人們生活中必不可少的蔬菜作物，具有藥理、經(jīng)濟(jì)、食用、營養(yǎng)等方面的價值。我國的辣椒制品種類繁多，如油辣椒、糟辣椒、辣椒醬等，辣椒制品多樣化推動了我國辣椒產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。辣椒在世界各地得到廣泛種植，但是同時也面臨著連作障礙、土壤傳播疫病、生長條件、產(chǎn)量及質(zhì)量等諸多問題，人們借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及辣椒分子育種技術(shù)，對辣椒的生長條件、栽培技術(shù)、病蟲害防治等方面進(jìn)行了研究[1-2]。

DNA是遺傳信息的載體，提取高質(zhì)量的DNA分子是開展植物基因組學(xué)及轉(zhuǎn)基因檢測研究的基礎(chǔ)，通常要求所提取的DNA分子應(yīng)具有較高的純度，且無斷裂、降解現(xiàn)象，提取過程中盡量少使用有毒化學(xué)藥品以保證下游工作的進(jìn)行[3-4]。辣椒中富含的酚類化合物、蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)會抑制DNA提取質(zhì)量，辣椒制品內(nèi)的酸、油、鹽、添加劑等也會影響DNA提取效率及質(zhì)量[5-6]。目前，國內(nèi)外已研究出許多提取植物DNA的方法，例如CTAB法、SDS法、堿裂解法、苯酚法、吸附柱法等[7-10]。

本次研究針對辣椒及其制品的成分特點，選取CTAB法、SDS法和吸附柱（試劑盒）等DNA提取具有代表性的方法，對辣椒及其制品進(jìn)行DNA提取，并比較提取效果，目的在于篩選出一種能簡單、快速、高效獲取高質(zhì)量DNA的方法，為辣椒及其制品分子生物學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

試驗材料有鮮辣椒、干辣椒、油辣椒和辣椒醬，均購自市場。

試劑有Premix Ex Taq（Probe qPCR）（熒光PCR反應(yīng)液）、DL2000 DNA Marker 、MiniBEST Universal Genomic DNA Ext-raction Kit（DNA提取試劑）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、蛋白酶K、氯仿/異戊醇（24∶1）、75%乙醇、GoldView核酸染料，均購買于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

儀器有實時熒光PCR儀（7500 Fast，美國Applied Bios-ystems）、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（DOC XRS，美國Bio-rad）、凝膠電泳儀（PowerPac 3000，美國Bio-rad ）、高速冷凍離心機（Microfuge 22R Centrifuge，美國Beckman Coulter）、超純水儀（Milli-Q，美國Milli-pore）、核酸蛋白測定儀（NanoDrop 2000，美國Thermo Scientific）、冷凍混合球磨儀（MM400，德國Retsch）、移液器、渦旋振蕩器、恒溫金屬浴鍋、生物安全柜等。

1.2? ? DNA提取方法

針對辣椒制品需做樣品前處理，采用洗滌方式，盡量去除樣品中的其他物質(zhì)（如鹽、糖、添加劑及其發(fā)酵產(chǎn)物等）。取適量樣品與2倍體積的超純水至50 mL離心管中，充分混勻，于離心機離心5 min（12 000 r/min），棄上清，重復(fù)洗滌3～5次。對于辣椒醬、油辣椒等液體樣品，可使用均質(zhì)器破壞樣品的穩(wěn)定性并加以分離、濃縮，取適量樣品與2倍體積的超純水至2 mL離心管中，充分混勻，于離心機離心5 min（12 000 r/min）棄上清，重復(fù)洗滌3～5次。

1.2.1? ? CTAB法。取2% CTAB抽提緩沖液于65 ℃金屬浴中預(yù)熱，取樣品約0.3 g置于球磨儀（液氮處理）研磨，加入700 μL 2% CTAB抽提緩沖液，輕輕攪動，將磨碎液分倒入1.5 μL滅菌離心管中，于 65 ℃金屬浴加熱振蕩10 min，加入5 μL 5 mol/L醋酸鉀溶液，混勻，再金屬浴20 min;取出離心管后置于冰上，加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），輕輕來回顛倒，充分混勻;放入4 ℃高速冷凍離心機中（12 000 r/min）離心15 min，吸取上清液500 μL放入另一離心管中，加入等體積異戊醇，顛倒混勻;12 000 r/min離心10 min后，棄上清，加入500 μL 75%乙醇，輕彈離心管，使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中，放置30 min，使DNA塊狀物上的不純物溶解;在12 000 r/min條件下離心5 min后棄上清，加入等量75%乙醇再洗30 min，然后再12 000 r/min離心5 min，棄上清液，并將離心管倒立于濾紙之上，自然風(fēng)干，加入50 μL TE溶液，使DNA溶解，置于-20 ℃冰箱冷凍保存、待用。

1.2.2? ? SDS法。稱取0.3 g樣品放入球磨儀（液氮處理）中研碎，迅速放入1.5 mL離心管中，加700 μL SDS提取液，充分混勻，于65 ℃金屬浴加熱振蕩30 min;取出離心管，加入5 μL 5 mol/L醋酸鉀溶液，混勻，再金屬浴20 min;取出離心管后放置在冰上，加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），輕輕地來回顛倒，使管液充分混勻;放入4 ℃高速冷凍離心機中（12 000 r/min）離心15 min，吸取上清液500 μL放入另一離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），顛倒混勻，然后12 000 r/min離心10 min，再吸取上清液500 μL于另一離心管中，重復(fù)上一步驟;吸取上清液于另一干凈的離心管中，加入0.6～1.0倍體積的異丙醇，輕輕地來回顛倒，出現(xiàn)絮狀DNA沉淀，再放入-20 ℃冰箱冷凍室30 min沉淀核酸;然后在12 000 r/min條件下離心5 min后，倒掉液體，加入500 μL 75%乙醇再洗滌30 min;在12 000 r/min條件下離心5 min之后，倒掉液體，并將離心管倒立于濾紙之上，自然風(fēng)干，加入50 μL TE溶液溶解DNA，放置于-20 ℃冰箱冷凍保存、待用。

1.2.3? ? 吸附柱法（試劑盒）。取0.3 g樣品加入1.5 mL離心管，再加入180 μL Buffer GL、20 μL? Proteinase K和10 μL RNase A（10 mg/mL），于56 ℃水?。ɑ蛴眉訜嵴袷幤鳎┲两M織完全裂解（30 min）;在12 000 r/min條件下離心5 min，取上清至另一離心管中，并加入200 μL Buffer GB和200 μL 100%乙醇，充分混勻;將溶液移至Spin Column中，在12 000 r/min條件下離心2 min，棄濾液，將500 μL Buffer WA加入至Spin Column中，在12 000 r/min條件下離心1 min，棄濾液;將500 μL 75%乙醇加入至Spin Column中，在12 000 r/min條件下離心1 min，棄濾液。重復(fù)該步驟1次，棄濾液后再離心2 min;將Spin Column安置于新的1.5 mL離心管上，在Spin Column膜中央處加入50 μL TE溶液，室溫靜置5 min;在12 000 r/min條件下離心5 min洗脫DNA，置于-20 ℃冰箱冷凍保存、待用。

1.3? ? DNA濃度及純度檢測

1.3.1? ? 核酸蛋白測定儀檢測。利用核酸蛋白測定儀檢測SDS法、CTAB法、吸附柱法提取鮮辣椒、干辣椒、油辣椒、辣椒醬中的DNA，測260 nm和280 nm處的吸光值，并記錄，通過OD260/OD280值判斷提取DNA的純度。

1.3.2? ? 瓊脂糖凝膠電泳檢測。吸取3 ？滋L DNA在1%瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行電泳，GoldView染色、蒸餾水沖洗后，放入化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。以電泳圖來確定提取的DNA完整度及RNA是否去除。

1.3.3? ? 實時熒光PCR擴(kuò)增檢測。為進(jìn)一步檢測SDS法、CTAB法、吸附柱法提取不同樣品的基因組DNA中是否存在PCR擴(kuò)增抑制。以提取得到的DNA為模板，以辣椒內(nèi)源基因CaATL1為參考基因，其具有保守、拷貝數(shù)穩(wěn)定等特征。所使用反應(yīng)體系見表1，擴(kuò)增程序見表2。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 核酸蛋白測定儀檢測結(jié)果

經(jīng)核酸蛋白分析儀測定表明，用CTAB法、SDS法、吸附柱法對鮮辣椒、干辣椒、油辣椒、辣椒醬提取，均能抽提得到DNA。從樣品的抽提物純度OD260/OD280比值（表3）來看，CTAB法提取物純度較低，其次是SDS法，而吸附柱法的提取物純度較高。

2.2? ? 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

如圖1所示，CTAB法、SDS法、吸附柱法均能從指定樣品中提取出DNA，均無大范圍明顯拖尾，說明DNA完整性較好。從泳道中可看出，吸附柱法提取的目標(biāo)條帶較亮，這與吸附柱的過濾吸附功能有關(guān)，對DNA基因組及其片段有較強的吸附獲取作用，在3種方法中以吸附柱法提取的DNA效率最高。而SDS法和CTAB法條帶較吸附柱法暗，提取到的DNA量相對較少，其中CTAB法對油辣椒和辣椒醬的DNA提取量最少，說明其針對深加工辣椒制品的DNA提取效率較低。

2.3? ? 實時熒光PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果

3種提取方法的鮮辣椒、干辣椒、油辣椒、辣椒醬基因組DNA均出現(xiàn)了PCR擴(kuò)增曲線。對比同個樣品，從實時熒光PCR擴(kuò)增曲線的Ct值大小比較可得出，吸附柱法?

3? ? 結(jié)論與討論

從深加工的辣椒制品中提取DNA比從辣椒原料中提取相對困難，因為辣椒制品中富含多種食品添加劑且加工過程復(fù)雜，影響DNA提取的質(zhì)量和完整度。經(jīng)過試驗比較，確定提取方法的效率由高到低依次為吸附柱法>SDS法 >CTAB法。

在分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)上，OD260/OD280值是判斷DNA純度的依據(jù)。符合要求、純度高的純化DNA，其OD260/OD280值在1.7～1.9之間，低于此范圍表示所提取樣品的DNA中含有蛋白質(zhì)污染，高于此范圍表明樣品中有RNA污染。提取的樣品中存在著較多的多酚、多糖，也是導(dǎo)致OD260/OD280值偏低的原因之一。因此，在操作過程中需要注意多糖、多酚等雜質(zhì)的去除。

通過核酸蛋白測定儀、瓊脂糖凝膠電泳分析及實時熒光定量PCR檢測進(jìn)行比較，確定采用吸附柱法提取核酸的效率較高。根據(jù)核酸提取的原理可以看出，使用過濾膜吸附的過程中，含有基因組的混合液與之進(jìn)行結(jié)合，在較短時間內(nèi)仍然可以獲得純度及濃度較高的DNA;而CTAB法、SDS法操作時間較長且通過異戊醇、異丙醇沉淀DNA，效率較低。并且在針對辣椒制品進(jìn)行提取時，更容易受到鹽類、蛋白質(zhì)、多糖的影響，故其所提取的DNA純度較低。本次研究針對辣椒及其制品的成分特點，確定吸附柱法為最適宜辣椒及其制品核酸提取的方法。該提取方法具有用時少、效率高、提取核酸質(zhì)量純且穩(wěn)定等優(yōu)點。

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