辛慧珍，潘璐彤，齊軍，熱衣汗古麗·吾不力，陳巧，石敏華， 張靜，靳馥源，張春賀，李洪濤，潘澤民*

(1 新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，新疆 石河子 832002； 2 石河子市第一中學(xué), 新疆 石河子 832000；3 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832002)

宮頸鱗癌是全球婦女中僅次于乳腺癌的常見的惡性腫瘤，是威脅婦女健康，導(dǎo)致婦女死亡的主要惡性腫瘤之一[1]。宮頸鱗癌的發(fā)生有多種因素，其中持續(xù)性感染高危型人乳頭瘤病毒是引起宮頸鱗癌，并發(fā)展為侵襲性癌的主要因素[2]。

人乳頭瘤病毒是一類感染人類上皮細(xì)胞的病毒，其中HPV16和HPV18型是宮頸鱗癌中重要的高危型病毒。這兩種高危型HPV是引起宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變以及宮頸鱗癌的重要因素，高危型的HPV的致癌蛋白E6和E7可以導(dǎo)致抑癌蛋白P53和pRb失活，引起細(xì)胞周期失調(diào)，細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[3]。因此，臨床檢測高危型HPV感染可以作為診斷宮頸鱗癌的重要生物標(biāo)志物。

Rab蛋白質(zhì)是小GTP酶家族的成員，同時，作為RAS蛋白家族的成員之一，Rab蛋白質(zhì)參與細(xì)胞的生長、分化, 被激活后就具有致癌性[4]。

目前為止，大約發(fā)現(xiàn)70多個含GTP酶的小Rab異構(gòu)體，其中Rab1-Rab43已經(jīng)在人類和小鼠中得到鑒定。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，Rab蛋白質(zhì)在囊泡的形成、運(yùn)輸、融合等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，而腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中又不可或缺地伴隨著囊泡的這些生理過程[5]。Rab27 A和Rab27B是Rab亞家族的成員，被證實(shí)具有71%的同源性[6]。

已有研究證明 Rab27 A、Rab27B與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的臨床特征關(guān)系密切，具體來說，這兩種蛋白質(zhì)所調(diào)節(jié)的胞吐作用在癌發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用[7]。

目前關(guān)于Rab27B與宮頸鱗癌之間的關(guān)系尚未見諸報道，本研究嘗試通過免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)分析宮頸鱗癌組織和慢性宮頸炎組織中Rab27B和HPV16/18蛋白質(zhì)表達(dá)水平，為認(rèn)識宮頸鱗癌的發(fā)病原因及發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌診斷的分子標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

研究對象為2012年6月到2014年12月在喀什人民醫(yī)院和伊犁友誼醫(yī)院就醫(yī)的患者，收集宮頸鱗癌患者49例和慢性宮頸炎患者37例連續(xù)石蠟標(biāo)本組織切片用于免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，病理切片均于4 ℃冰箱保存。

患者中位年齡47歲，最小患者年齡30歲，最大患者年齡72歲。標(biāo)本組織都經(jīng)過兩位有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師進(jìn)行診斷，所有患者經(jīng)書面知情同意參與本研究。

1.2 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

Rab27B和HPV16/18 E6蛋白質(zhì)在宮頸組織中的表達(dá)采用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測。免疫組化實(shí)驗(yàn)中Rab27B抗體稀釋和HPV16/18 E6抗體稀釋均為1∶200，抗原修復(fù)方式是使用pH 6.0的枸櫞酸高壓修復(fù)8 min。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)(IHC)Envision法染色兩步法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)代替一抗作為陰性對照。Rab27B抗體購于中國武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，Anti-HPV16 E6 + HPV18 E6抗體[C1P5]，購于美國Abcam公司。

實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)過烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、冷卻、洗片、孵育一抗、復(fù)溫、洗片、孵育二抗、洗片、顯色、復(fù)染及藍(lán)化、脫水及透明過程。

免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)對慢性宮頸炎組織和宮頸鱗癌組織進(jìn)行HPV16/18 E6蛋白的檢測及其Rab27B蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測。

結(jié)果判讀采用雙盲法：由兩位病理學(xué)專家獨(dú)立雙盲閱片，結(jié)果取其平均值。采用陽性細(xì)胞所占百分比和細(xì)胞染色強(qiáng)度兩者乘積來判斷陽性強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測慢性宮頸炎和宮頸鱗癌組織HPV16/18 E6的表達(dá)

HPV16/18感染通過免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)在慢性宮頸炎組織和宮頸鱗癌組織中進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌組織中HPV16/18感染高于慢性宮頸炎組織。圖1 A顯示慢性宮頸炎組織HPV16/18 E6表達(dá)為陰性，表明HPV16/18感染陰性，而圖1B顯示宮頸鱗癌組織感染HPV16/18陽性。

A：慢性宮頸炎組織 B：宮頸鱗癌組織圖1 HPV16/18 E6在慢性宮頸炎組織和宮頸鱗癌組織的表達(dá)水平(×200)Fig.1 The expression level of HPV16/18 E6 protein in chronic cervicitis tissue and cervical cancer tissue by immunohistochemistry(×200)

2.2 慢性宮頸炎和宮頸鱗癌組織HPV16/18感染分析

通過對37例慢性宮頸炎組織和49例宮頸鱗癌組織HPV16/18免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)慢性宮頸炎組織感染率為13.5%，而宮頸鱗癌組織感染率為46.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.3 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測Rab27B在慢性宮頸炎和宮頸鱗癌組織中的表達(dá)

通過在慢性宮頸炎和宮頸鱗癌組織中，檢測Rab27B蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)慢性宮頸炎組織中Rab27B陰性表達(dá)標(biāo)本數(shù)量多，而陽性表達(dá)標(biāo)本數(shù)量少。在宮頸鱗癌組織中，Rab27B蛋白表達(dá)陰性標(biāo)本少，而陽性和中、強(qiáng)陽性表達(dá)的標(biāo)本數(shù)量多(圖2)。

表1 HPV16/18 E6在慢性炎癥組織、 宮頸鱗癌組織中的表達(dá)Tab.1 The expression level of HPV16/18 E6 in chronic cervicitis tissue and cervical cancer tissue

注： *P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A：慢性宮頸炎組織Rab27B表達(dá)陰性； B：宮頸鱗癌組織Rab27B表達(dá)弱陽性； C：宮頸鱗癌組織Rab27B表達(dá)中強(qiáng)度陽性；D：宮頸鱗癌組織Rab27B表達(dá)強(qiáng)陽性圖2 Rab27B在慢性宮頸炎組織和宮頸鱗癌組織中的表達(dá)水平(×200)Fig.2 The expression level of Rab27B in chronic cervicitis tissue and cervical cancer tissue by immunohistochemistry(×200)

2.4 Rab27B蛋白質(zhì)在慢性宮頸炎和宮頸鱗癌組織中表達(dá)分析

Rab27B蛋白質(zhì)表達(dá)水平在慢性宮頸炎組織中陰性表達(dá)占35.1%，中、強(qiáng)陽性表達(dá)為32.4%。在宮頸鱗癌組織中陰性表達(dá)占12.2%，中、強(qiáng)陽性表達(dá)為63.3%。兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 Rab27B蛋白質(zhì)在慢性炎癥組織、宮頸鱗癌組織中的表達(dá)Tab.2 The expression level of Rab27B in chronic cervicitis tissue and cervical cancer tissue

注：*P<0.05，結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 宮頸鱗癌組織中Rab27B和HPV16/18 E6蛋白質(zhì)的表達(dá)相關(guān)性分析

通過將宮頸鱗癌組織中Rab27B蛋白質(zhì)表達(dá)水平與HPV16/18 E6關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)49例宮頸鱗癌組織中有24例Rab27B、HPV16/18 E6同時表達(dá)陽性，3例Rab27B表達(dá)陰性但HPV16/18 E6表達(dá)陽性，同時49例宮頸鱗癌組織中有4例Rab27B、HPV16/18 E6同時表達(dá)陰性，18例Rab27B表達(dá)陽性但HPV16/18 E6表達(dá)陰性。表明Rab27B蛋白質(zhì)表達(dá)陽性標(biāo)本同時出現(xiàn)HPV16/18的感染標(biāo)本數(shù)量多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 Rab27B蛋白質(zhì)和HPV16/18 E6在 宮頸鱗癌組織中的表達(dá)Tab.3 The expression level of Rab27B protein in cervical cancer tissue

注：*P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 慢性宮頸炎組織中Rab27B和HPV16/18 E6蛋白質(zhì)的表達(dá)相關(guān)性分析(表4)

表4 Rab27B蛋白質(zhì)和HPV16/18 E6在 慢性宮頸炎組織中的表達(dá)Tab.4 The expression level of Rab27B protein in chronic cervicitis tissue

注：*P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

通過將慢性宮頸炎組織中Rab27B蛋白質(zhì)表達(dá)水平與HPV16/18 E6關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)37例慢性宮頸炎組織中有2例Rab27B和HPV16/18 E6同時表達(dá)陽性，有3例Rab27B表達(dá)陰性但HPV16/18 E6表達(dá)陽性，同時37例慢性宮頸炎組織中有22例Rab27B表達(dá)陽性但HPV16/18 E6表達(dá)陰性，10例Rab27B和HPV16/18 E6同時表達(dá)陰性。表明慢性宮頸炎組織中Rab27B蛋白質(zhì)表達(dá)陽性標(biāo)本同時出現(xiàn)HPV16/18的感染數(shù)量少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

3 討論

目前，宮頸鱗癌的發(fā)病率居高不下，成為女性健康的“第二殺手”。世界范圍內(nèi)，已有充分的證據(jù)證明持續(xù)性的HPV感染是引發(fā)宮頸鱗癌的首要因素。在HPV的諸多亞型中，HPV16和HPV18兩種病毒是引起宮頸鱗癌的主要兩種病毒，一般HPV16病毒在宮頸鱗癌中感染率為50% 以上，HPV18在宮頸鱗癌感染在20% 左右[8]，也有研究顯示，這兩種病毒可以共同感染宮頸鱗癌組織，一起發(fā)揮致癌作用[9]。

人Rab27B基因定位于人染色體18q21.2，編碼218個氨基酸的蛋白質(zhì)。 在成人組織中，Rab27B在多種分化的分泌上皮細(xì)胞中表達(dá)，包括乳腺、胃腸道和前列腺分泌上皮細(xì)胞等[10]。研究表明， Rab27B促進(jìn)雌激素受體(ER)陽性乳腺癌細(xì)胞系的侵襲性生長和轉(zhuǎn)移，并且表達(dá)增加與患者預(yù)后不良有關(guān)[11]。此外，Rab27B通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)的表達(dá)和活化，促進(jìn)膠質(zhì)瘤侵襲[12]。在肝癌組織中，Rab27B激活MMP2的分泌使肝癌惡性水平增加[13]。Rab27B對人胰腺癌細(xì)胞侵襲、增殖、凋亡和化療耐藥也有重要影響[14]。此外，還有大量對Rab27B與胃腸道腫瘤[15]、肺部腫瘤[16]等發(fā)生發(fā)展的相關(guān)關(guān)系的研究，都證明Rab27B促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，故其可作為潛在的腫瘤標(biāo)記物來判斷預(yù)后，亦可為臨床治療的過程提供參考。然而，對Rab27B與宮頸鱗癌發(fā)生與發(fā)展的關(guān)系卻不十分清楚。

基于目前為止對于Rab27B與多種腫瘤遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)系的研究，我們通過在慢性宮頸炎和宮頸鱗癌組織中檢測Rab27B蛋白質(zhì)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌組織中該蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯高于慢性宮頸炎組織。特別是宮頸鱗癌組織中等強(qiáng)度陽性和強(qiáng)陽性的表達(dá)多于慢性宮頸炎組織，可能提示Rab27B蛋白質(zhì)表達(dá)與宮頸鱗癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。檢測慢性宮頸炎組織和宮頸鱗癌組織中HPV16/18 E6表達(dá)，發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌組織中HPV16/18 E6表達(dá)量明顯高于慢性宮頸炎組織。

通過研究宮頸鱗癌組織中Rab27B與HPV16/18 E6表達(dá)的相關(guān)關(guān)系發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗癌組織中Rab27B表達(dá)量高并且伴隨著HPV16/18 E6同時表達(dá)。提示Rab27B蛋白質(zhì)的表達(dá)結(jié)合HPV16/18的感染可能與宮頸鱗癌的發(fā)生與發(fā)展相關(guān)。然而，通過在慢性宮頸炎組織中對Rab27B和HPV16/18表達(dá)水平相關(guān)性檢測，發(fā)現(xiàn)大部分標(biāo)本Rab27B表達(dá)水平較低同時也伴隨HPV16/18表達(dá)水平低，進(jìn)而說明Rab27B和HPV16/18在慢性宮頸炎組織表達(dá)水平可能相關(guān)。

外泌體是細(xì)胞分泌的膜囊泡，具有一定的結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)特征，并能傳遞侵襲生長信號來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，有研究表明它可能參與細(xì)胞間通訊和感染性疾病的發(fā)病機(jī)制。Honegger等[17]的研究結(jié)果提示宮頸癌細(xì)胞外泌體與癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控有關(guān), 從而為早期診斷提供了新的可能性。Rab27B是HPV陽性細(xì)胞系HeLa、SiHa關(guān)鍵的外泌體[18-19]，我們的研究在體外初步檢測了HPV16/18陽性的宮頸癌組織中Rab27B的表達(dá)情況，為其是否參與宮頸鱗癌的發(fā)生與發(fā)展和進(jìn)一步研究其作用機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

綜上所述，宮頸鱗癌組織中Rab27B蛋白質(zhì)的異常表達(dá)結(jié)合HPV16/18蛋白質(zhì)的表達(dá)，可能與宮頸鱗癌的發(fā)生與發(fā)展相關(guān)。