陳明，穆凱熱姆·阿卜來(lái)提，劉政，王曉東*

(1 石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 石河子 832003; 2 新疆農(nóng)墾科學(xué)院植物保護(hù)研究所,新疆石河子 832003)

棉花黃萎病是由大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaKleb.)引起的土傳性維管束系統(tǒng)病害。大麗輪枝菌具有寄主范圍廣泛、傳播速度快、抗逆性強(qiáng)和變異性大等特點(diǎn)[1]，該病一旦發(fā)生，棉田輕者減產(chǎn)30%左右，重者達(dá)到50%以上，甚至絕收[2]。20世紀(jì)90年代以來(lái)，由于常年連作和秸稈還田等原因[3]，新疆棉花黃萎病危害逐年加重。目前，國(guó)內(nèi)外防治棉花黃萎病主要以選育抗病品種、農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治等綜合措施[4-6]。選育抗病品種是防治棉花黃萎病最有效的措施之一，但因高抗種質(zhì)資源缺乏、選育周期長(zhǎng)、病菌致病力變異大，棉花抗性極易喪失等原因，致使育種工作進(jìn)展緩慢[7]。棉花黃萎病屬維管束病害，病程較長(zhǎng)，且病菌易形成抗逆性很強(qiáng)的微菌核，化學(xué)藥劑防治效果欠佳[8]。目前，尚無(wú)根治棉花黃萎病的理想藥劑。生物防治能減少化學(xué)藥劑的使用，避免環(huán)境污染，且對(duì)有益微生物無(wú)影響，符合現(xiàn)代綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的要求，是棉花黃萎病防治的一條較為理想的途徑。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者已研究表明利用真菌[9]、細(xì)菌[10]、放線(xiàn)菌[11-12]能較好的拮抗棉花黃萎病菌。其中，放線(xiàn)菌是廣泛存在于自然界中的微生物種群，能產(chǎn)生功能多樣的次級(jí)代謝物質(zhì)，具有巨大的利用價(jià)值，在防治土傳真菌病害中有其特有的優(yōu)勢(shì)，取得了很好的效果[13]。柳成斌[14]報(bào)道拮抗放線(xiàn)菌發(fā)酵液可以通過(guò)抑制菌落生長(zhǎng)、分生孢子萌發(fā)來(lái)抑制黃萎病菌的生長(zhǎng)繁殖，并對(duì)棉花黃萎病有很好的田間防治效果。另有研究[15]表明拮抗菌可以誘導(dǎo)大麗輪枝菌超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和多酚氧化酶(PPO)酶活的降低，并使大麗輪枝菌膜脂過(guò)度氧化，丙二醛(MDA)含量升高，病原菌質(zhì)膜的完整性被破壞。拮抗放線(xiàn)菌發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎病菌的抑菌作用及田間防效報(bào)道總體上較少。

本實(shí)驗(yàn)室前期篩選出一株對(duì)棉花黃萎病原菌有抑菌效果的放線(xiàn)菌菌株LG-9，經(jīng)平板對(duì)峙測(cè)定，證明菌株LG-9對(duì)棉花黃萎病菌具有顯著的抑制作用。本研究以放線(xiàn)菌LG-9為對(duì)象，測(cè)定其發(fā)酵粗提液對(duì)棉花黃萎病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)和抗氧化相關(guān)酶活性的影響，為安全有效防治棉花黃萎病及揭示放線(xiàn)菌LG-9對(duì)黃萎病菌的抑菌作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供試放線(xiàn)菌菌株LG-9和棉花黃萎病菌菌株301-3由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

高氏1號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水1 L，pH 7.2。以不加瓊脂粉為高氏1號(hào)培養(yǎng)液。

小米培養(yǎng)基：小米10 g、葡萄糖10 g、蛋白胨3 g、NaCl 2.5 g、CaCO32.5 g、蒸餾水1 L，pH7.2。

馬鈴薯瓊脂葡萄糖培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar,PDA)、馬鈴薯瓊脂葡萄糖培養(yǎng)液(Potato Dextrose Broth,PDB)和查氏培養(yǎng)液參考方中達(dá)[16]方法制備。以上培養(yǎng)基均121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 供試棉花種子

棉花品種為新陸早60，由新疆農(nóng)墾科學(xué)院棉花所提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化及發(fā)酵粗提液的制備

將保藏的菌株LG-9接種于高氏1號(hào)培養(yǎng)基上，28 ℃活化4 d，挑取菌絲塊接種于裝有100 mL高氏1號(hào)培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，160 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)4 d，制備種子液。按6%的比例接種到裝有100 mL小米培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于160 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)3 d，經(jīng)1×104r/min離心20 min，取其上清液經(jīng)無(wú)菌微孔濾膜(孔徑0.45 μm)過(guò)濾，過(guò)濾液為發(fā)酵粗提液，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｓ糜谔镩g防效試驗(yàn)的LG-9發(fā)酵濾液，不經(jīng)離心和過(guò)濾處理。

1.2.2 棉花黃萎病菌孢子懸浮液制備

將棉花黃萎病菌菌株301-3接種到PDA培養(yǎng)平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d后，挑取豆粒大小的菌絲塊，接種于PDB中，28 ℃、振蕩培養(yǎng)3 d后，用4層無(wú)菌紗布過(guò)濾，在生物顯微鏡下借助紐鮑爾血球計(jì)數(shù)板，將棉花黃萎病菌分生孢子液配制成1×108CFU/mL，備用。

1.2.3 發(fā)酵粗提液對(duì)棉花黃萎病菌菌落生長(zhǎng)的影響

將一定量發(fā)酵粗提液與冷卻至45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基充分混勻，發(fā)酵粗提液在培養(yǎng)基中稀釋終濃度分別為5、25、50、100和250倍，倒入培養(yǎng)皿，每皿25 mL，待培養(yǎng)基晾干后備用。用直徑7 mm的無(wú)菌打孔器在28 ℃、培養(yǎng)7 d的棉花黃萎病菌菌落邊緣打孔，制備菌餅。挑取黃萎菌菌餅置于含有發(fā)酵粗提液的PDA平板中央，以含無(wú)菌水的PDA平板作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。28 ℃培養(yǎng)6、8、10、12、14 d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落生長(zhǎng)量。按如下公式計(jì)算菌落生長(zhǎng)抑制率：

1.2.4 發(fā)酵粗提液對(duì)棉花黃萎病菌產(chǎn)孢量的影響

將1.2.3中培養(yǎng)14 d的菌落用7 mm的無(wú)菌打孔器沿菌落邊緣打孔，將不同處理的10片菌餅放入離心管中，用無(wú)菌水清洗菌落表面，定量孢子液為10 mL。借助紐鮑爾血球計(jì)數(shù)板在生物顯微鏡下觀(guān)察，測(cè)定分生孢子液的濃度，計(jì)算產(chǎn)孢抑制率。以不加發(fā)酵粗提液的棉花黃萎病菌培養(yǎng)平板為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次。產(chǎn)孢抑制率計(jì)算公式如下：

1.2.5 發(fā)酵粗提液對(duì)棉花黃萎病菌分生孢子萌發(fā)的影響

先將發(fā)酵粗提液用PDB分別進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尳K濃度為5、25、50、100和250倍，分別吸取100 μL 1×108CFU/mL黃萎病菌孢子懸浮液加入到1 mL稀釋液中。然后吸取100 μL不同稀釋倍數(shù)處理的的孢子懸液放置于無(wú)菌凹玻片上，將凹玻片放置于底部置有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)18 h，生物顯微鏡下用紐鮑爾血球計(jì)數(shù)板隨機(jī)觀(guān)察100個(gè)孢子，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)孢子數(shù)，計(jì)算分生孢子萌發(fā)抑制率。以分生孢子萌發(fā)出的芽管長(zhǎng)度超過(guò)孢子短直徑一半時(shí)即判為孢子萌發(fā)，否則為未萌發(fā)，以不加發(fā)酵粗提液的PDB為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次。計(jì)算公式如下：

1.2.6 發(fā)酵粗提液對(duì)棉花黃萎病菌抗氧化功能的影響

1.2.6.1 棉花黃萎病菌預(yù)處理

將棉花黃萎病菌菌落用7 mm的無(wú)菌打孔器沿邊緣打孔，挑取菌餅接種于査氏培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)3 d，每100 mL査氏培養(yǎng)液中接入5 mL黃萎病菌孢子懸浮液，180 r/min，28 ℃培養(yǎng)72 h。離心收集菌體，用0.1 mol/L PBS(pH7.4)清洗3次，轉(zhuǎn)接入含LG-9發(fā)酵粗提液5倍稀釋液的査氏培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)(以添加蒸餾水為對(duì)照)。取培養(yǎng)0、6、12、18和24 h的菌液，離心收集菌體，0.1 mol/L PBS清洗3次，-80 ℃冷凍后備用。

1.2.6.2 棉花黃萎病菌酶液的提取

取出冷凍的菌體稱(chēng)重后，加液氮研磨，按重量(g)∶體積(mL)為1∶9的比例加入生理鹽水懸浮，制備棉花黃萎病菌粗酶液。

1.2.6.3 測(cè)定指標(biāo)

測(cè)定SOD、CAT、PPO和MDA具體試驗(yàn)操作和計(jì)算方法采用由南京建成生物工程研究所購(gòu)買(mǎi)的試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

菌體粗酶液中蛋白濃度測(cè)定：取3支試管，標(biāo)記為空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管，分別加入雙蒸水、0.563 g/L蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和粗酶液50 μL后，每管加入考馬斯亮藍(lán)顯色液3 mL，混勻，靜置10 min，波長(zhǎng)595 nm，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各管吸光度值(ΔA=A測(cè)定-A空白；ΔA1=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白)，按公式計(jì)算。粗酶液蛋白濃度(g/L)=ΔA/ΔA1×蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

SOD測(cè)定：取2支試管，標(biāo)記為測(cè)定管和對(duì)照管，各加入SOD試劑盒提供的試劑1應(yīng)用液1 mL、試劑2、試劑3和試劑4各0.1 mL，然后測(cè)定管加入50 μL粗酶液，對(duì)照管加入50 μL雙蒸水，旋渦混勻，37 ℃恒溫水浴40 min后，測(cè)定管和對(duì)照管各加入2 mL顯色劑，混勻，室溫放置10 min，波長(zhǎng)550 nm，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各管吸光度值(ΔA=A對(duì)照-A測(cè)定)，按公式計(jì)算。SOD活力(U/mgprot)=(ΔA/A對(duì)照)/50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)/粗酶液蛋白濃度(mgprot/mL)。

CAT測(cè)定：測(cè)定管和對(duì)照管各加入CAT試劑盒提供的試劑1(37 ℃預(yù)溫)1 mL、試劑2 0.1 mL，測(cè)定管加入50 μL粗酶液混勻，37 ℃反應(yīng)1 min后，各管加入試劑3 1 mL，試劑4 0.1 mL，對(duì)照管加入50 μL粗酶液，混勻，波長(zhǎng)405 nm，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各管吸光度值(ΔA=A對(duì)照-A測(cè)定)，按公式計(jì)算。CAT活力(U/mgprot)=ΔA×271×0.33/粗酶液蛋白濃度(mgprot/mL)。

PPO測(cè)定：測(cè)定管和對(duì)照管先后加入PPO試劑盒提供的緩沖液0.6 mL，基質(zhì)液0.15 mL，測(cè)定管加入粗酶液100 μL，對(duì)照管加入煮沸處理的粗酶液100 μL，37 ℃恒溫反應(yīng)10 min后，立即90 ℃水浴5 min，取出后流水冷卻，1×104r/min，離心10 min，取上清于波長(zhǎng)420 nm，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各管吸光度值(ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照)，按公式計(jì)算。PPO活力(U/mgprot)=ΔA/0.01×0.6×(1/反應(yīng)液總體積)/反應(yīng)時(shí)間/粗酶液蛋白濃度(mgprot/mL)。

MDA含量測(cè)定：取4支試管，標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管、空白管和對(duì)照管，各管加入MDA試劑盒提供的試劑1 100 μL，空白管和標(biāo)準(zhǔn)管分別加入無(wú)水乙醇100 μL和10 nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，測(cè)定管和對(duì)照管加入粗酶液100 μL，混勻后，標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管和空白管各加入試劑2和試劑3 1.5 mL，對(duì)照管加入試劑2和50%冰乙酸1.5 mL，旋渦混勻，95 ℃水浴40 min，取出后流水冷卻，然后3500 r/min，離心10 min，取上清于波長(zhǎng)532 nm，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各管吸光度值(ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照；ΔA2=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白)，按公式計(jì)算。MDA含量(nmol/mgprot)=ΔA/ΔA2×10/粗酶液蛋白濃度(mgprot/mL)。

1.2.7 田間防效測(cè)定

1.2.7.1 黃萎病菌麥粒培養(yǎng)物制備

將清洗過(guò)的小麥在水里浸泡24 h，使其膨脹，取出放在報(bào)紙上30 min晾干，將棉籽殼浸泡30～60 min，和小麥混合均勻，裝入培養(yǎng)袋，100 ℃滅菌120 min備用。無(wú)菌條件下接種棉花黃萎病菌孢子懸浮液于麥粒培養(yǎng)基中，室溫條件下培養(yǎng)1個(gè)月。

1.2.7.2 防效試驗(yàn)

放線(xiàn)菌LG-9對(duì)棉花黃萎病的田間防效試驗(yàn)于2016年5—10月，在石河子大學(xué)試驗(yàn)站進(jìn)行，播種時(shí)間為5月3日。處理組播種前棉種用LG-9發(fā)酵粗提液5倍稀釋液浸種18 h，對(duì)照組棉種用清水浸泡相同時(shí)間。播種前將培養(yǎng)好的黃萎病菌麥粒培養(yǎng)物均勻撒入播種行土壤以下5 cm，之后用土覆蓋。每個(gè)處理播種5 m長(zhǎng)，1膜2行，行間距40 cm，株間距10 cm，重復(fù)3次，用手點(diǎn)播。當(dāng)棉苗長(zhǎng)至2～3片真葉時(shí)，處理組用LG-9培養(yǎng)濾液灌根處理，每株50 mL，1周1次，共3次，對(duì)照組用自來(lái)水處理。棉田常規(guī)水肥管理，直到收獲前15 d。播種150 d后剖桿調(diào)查棉株發(fā)病情況。依據(jù)黃萎病在棉花植株上發(fā)病情況的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查，0級(jí)：正常，橫切面無(wú)褐色斑點(diǎn)；1級(jí)：橫切面有零星褐色斑點(diǎn)，所占面積在25%以下；2級(jí)：褐色面積占橫切面的25～50%；3級(jí)：褐色面積占橫切面的50～75%；4級(jí)：褐色面積占橫切面的75%以上，橫切面幾乎全變褐色。計(jì)算公式：

發(fā)病率(%)=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查株數(shù)×100%

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel進(jìn)行處理，采用SASS19.0統(tǒng)計(jì)軟件中的方差分析程序進(jìn)行差異顯著性分析。比較處理之間的差異采用Duncan氏新復(fù)極差法(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵粗提液對(duì)棉花黃萎病菌菌落生長(zhǎng)的影響

如圖1所示，不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵粗提液對(duì)大麗輪枝菌菌落生長(zhǎng)均有抑制作用，但隨著發(fā)酵粗提液稀釋倍數(shù)的增加，抑制率逐漸降低。5倍稀釋液抑制作用最強(qiáng)，培養(yǎng)8 d時(shí)，菌落生長(zhǎng)抑制率最大，為76.77%，培養(yǎng)到第14 d時(shí)，抑制率仍可保持在67.36%。250倍稀釋液抑制菌落生長(zhǎng)效果最差，抑制率不足10%。

圖1 LG-9發(fā)酵液對(duì)黃萎病菌菌落生長(zhǎng)的影響Fig.1 The inhibition effect of the LG-9 fermentation liquid on V.dahliae mycelia growth

2.2 發(fā)酵粗提液對(duì)棉花黃萎病菌產(chǎn)孢量的影響

由圖2可知，不同稀釋濃度的放線(xiàn)菌菌株LG-9發(fā)酵粗提液均不同程度抑制棉花黃萎病菌產(chǎn)生分生孢子。5倍稀釋液對(duì)棉花黃萎病菌孢子形成抑制作用最明顯，抑制率為84.35%。50倍稀釋液抑制率最小，為35.41%，與100倍和250倍發(fā)酵粗提液抑制率差異顯著。

圖2 LG-9發(fā)酵液對(duì)黃萎病菌產(chǎn)孢量的影響Fig.2 The inhibition effect of the LG-9 fermentation liquid on V.dahliae sporulation quantity

2.3 發(fā)酵粗提液對(duì)棉花黃萎病菌孢子萌發(fā)的影響

由圖3可知，發(fā)酵粗提液隨著稀釋倍數(shù)的增加，對(duì)分生孢子萌發(fā)的抑制率呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。5倍稀釋液的抑制率最大，為80.00%，250倍稀釋液的抑制率最低，為26.15%。由此說(shuō)明，不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵粗提液均能夠?qū)Υ篼愝喼逆咦用劝l(fā)產(chǎn)生抑制作用。

圖3 LG-9發(fā)酵液對(duì)黃萎病菌孢子萌發(fā)的影響Fig.3 The inhibition effect of the LG-9 fermentation liquid on the spore germination of V.dahliae

2.4 發(fā)酵粗提液對(duì)棉花黃萎病菌抗氧化功能的影響

2.4.1 發(fā)酵粗提液對(duì)棉花黃萎病菌SOD活力的影響

由圖4可知，經(jīng)LG-9發(fā)酵粗提液處理棉花黃萎病菌后，除0 h外，各時(shí)間點(diǎn)SOD酶活力值均比對(duì)照低，且兩者間差異顯著。在6 h時(shí)，棉花黃萎病菌SOD酶活力值最低，處理為0.597 U/mgprot，對(duì)照為6.179 U/mgprot。表明LG-9發(fā)酵粗提液顯著影響棉花黃萎病菌的SOD酶活力。

圖4 LG-9發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎病菌SOD活力的影響Fig.4 Effect of LG-9 fermentation liquid on SOD activity of V.dahliae

2.4.2 發(fā)酵粗提液對(duì)棉花黃萎病菌CAT活力的影響

由圖5可知,經(jīng)LG-9發(fā)酵粗提液處理棉花黃萎病菌后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，棉花黃萎病菌CAT酶活力值逐漸下降，18 h后，CAT酶活力值與對(duì)照差異顯著。24 h時(shí)，處理的棉花黃萎病菌CAT酶活力值最低，為0.242 U/mgprot。表明經(jīng)LG-9發(fā)酵粗提液處理棉花黃萎病菌能顯著影響其CAT酶的活力。

圖5 LG-9發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎病菌CAT活力的影響Fig.5 Effect of LG-9 fermentation liquid on CAT activity of V.dahliae

2.4.3 發(fā)酵粗提液對(duì)棉花黃萎病菌PPO活力的影響

由圖6可知,經(jīng)LG-9發(fā)酵粗提液處理棉花黃萎病菌，0～24 h內(nèi)棉花黃萎病菌PPO酶活力值與對(duì)照值略呈正態(tài)分布，12 h后，棉花黃萎病菌PPO酶活值隨時(shí)間延長(zhǎng)，呈逐漸下降趨勢(shì)，且與對(duì)照酶活值差異顯著。

圖6 LG-9發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎病菌PPO活力的影響Fig.6 Effect of LG-9 fermentation liquid on PPO activity of V.dahliae

2.4.4 發(fā)酵粗提液對(duì)棉花黃萎病菌MDA含量的影響

由圖7可知,對(duì)照組和處理組棉花黃萎病菌培養(yǎng)至6 h，MDA的含量有所增加。12 h后，兩組棉花黃萎病菌MDA含量大幅減少，對(duì)照組顯著低于處理組，18 h后，處理組的MDA含量有所增加，為10.566 nmol/mgprot。表明隨著LG-9發(fā)酵粗提液處理時(shí)間的不同，對(duì)棉花黃萎病菌膜系統(tǒng)造成的破壞程度不同。

圖7 LG-9發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎病菌MDA含量的影響Fig.7 Effect of LG-9 fermentation liquid on MDA content of V.dahliae

2.5 田間防效測(cè)定

由表1可知，拮抗菌LG-9對(duì)棉花黃萎病有一定生防效果，發(fā)酵濾液3次灌根處理，棉株發(fā)病率為28.62%，低于對(duì)照41.13%，剖桿檢查病情指數(shù)為12.07，低于對(duì)照23.69。在150 d的防效為49.07%。

表1 放線(xiàn)菌LG-9防治棉花黃萎病效果測(cè)定Tab.1 Biocontrol efficiency of field trials for the control of Verticillium wilt with actinomycetes LG-9

3 結(jié)論與討論

(1)LG-9發(fā)酵粗提液對(duì)棉花黃萎病菌生長(zhǎng)的影響及田間防治效果

本研究結(jié)果顯示，放線(xiàn)菌菌株LG-9發(fā)酵粗提液對(duì)棉花黃萎病菌具有顯著抑制作用。其中，5倍稀釋液抑菌活性最大，對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)抑制率分別為76.77%、84.35%和80.00%，表明拮抗放線(xiàn)菌菌株LG-9具有控制棉花黃萎病的生防潛力。大麗輪枝菌在土壤中越冬，萌發(fā)繁殖后侵染棉株的根尖進(jìn)入維管束定殖，進(jìn)而危害整個(gè)植株[17]。棉花黃萎病防治困難，主要是因?yàn)橥寥乐械恼婢敝丑w和微菌核萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲能直接侵染棉花的根尖部分，并堵塞維管束組織。Presley等[18]研究發(fā)現(xiàn)黃萎病菌侵入棉株后對(duì)木質(zhì)部的侵染主要是由分生孢子介導(dǎo)的，菌絲和分生孢子在侵染植株過(guò)程中起著重要的作用。表明對(duì)菌絲和分生孢子的抑制活性是拮抗菌對(duì)病原菌主要的作用方式之一。柳成賓等[14]篩選出棉花黃萎病菌拮抗放線(xiàn)菌TRM42561，確定其發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎菌菌絲生長(zhǎng)抑制率為83.75%，孢子萌發(fā)抑制率為68.75%后，進(jìn)行田間防效試驗(yàn)，發(fā)酵液田間灌根處理30 d，通過(guò)調(diào)查葉片發(fā)病情況，得出防效為41.65%。許多研究[19]都是通過(guò)葉片發(fā)病癥狀調(diào)查棉花黃萎病的發(fā)病情況，然而由于環(huán)境因素，棉花黃萎病在發(fā)病初期癥狀不易辨別，影響了病害調(diào)查的準(zhǔn)確性，而且有些棉田在生長(zhǎng)末期棉株發(fā)病率在80%以上，發(fā)病情況更嚴(yán)重[20]，通過(guò)生長(zhǎng)末期解剖棉株莖稈調(diào)查能更好反應(yīng)植株的發(fā)病情況。本試驗(yàn)通過(guò)解剖莖稈法調(diào)查棉株的發(fā)病情況，得出放線(xiàn)菌LG-9培養(yǎng)濾液3次灌根處理，到棉株收獲時(shí)，對(duì)棉花黃萎病的防效達(dá)到了49.07%，能更好的反映出菌株LG-9的生防效果及防效的持久性。

(2)LG-9發(fā)酵粗提液對(duì)棉花黃萎病菌抗氧化相關(guān)酶活力及膜系統(tǒng)的影響

在非生物脅迫下，SOD、CAT，以及PPO在抵抗外界物質(zhì)刺激，延緩機(jī)體衰老方面發(fā)揮重要的作用[21]。MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的終產(chǎn)物，其含量變化能體現(xiàn)出膜系統(tǒng)的受損情況，細(xì)胞中MDA含量增加表明細(xì)胞在衰老或遇到逆境時(shí)細(xì)胞質(zhì)膜的過(guò)氧化程度提高，質(zhì)膜的完整性被破壞[22]。趙君潔[15]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌降低了大麗輪枝菌SOD和CAT酶活力，破壞了大麗輪枝菌的脂膜使MDA含量升高，對(duì)大麗輪枝菌產(chǎn)生了抑制作用。本研究中，菌株LG-9發(fā)酵粗提液誘導(dǎo)了棉花黃萎病菌抗氧化相關(guān)酶SOD、CAT和PPO酶活力的降低及MDA含量的升高，破壞了病菌的膜系統(tǒng)。由此表明對(duì)病原菌抗氧化酶的影響和細(xì)胞質(zhì)膜的破壞可能是拮抗菌對(duì)棉花黃萎病菌的抑菌作用之一。在聯(lián)合培養(yǎng)0～24 h期間，由于病菌接種初始階段為適應(yīng)期，6～12 h后，隨病菌的生長(zhǎng)繁殖，對(duì)照組孢子活力逐漸增強(qiáng)，抗氧化物酶活力隨之增強(qiáng)，而處理組因病菌生長(zhǎng)繁殖被抑制，抗氧化酶活性低于對(duì)照組。培養(yǎng)后期，可能由于病菌進(jìn)入衰弱期，對(duì)照組和處理組黃萎病菌SOD、CAT、PPO活力均降低。拮抗菌對(duì)棉花黃萎病菌抗氧化相關(guān)酶活力及膜系統(tǒng)影響的研究對(duì)拮抗菌的應(yīng)用有重要的意義。