梁忠泉 ，劉暢，楊志娜，謝永新 ，袁昌隆*

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊北戴河康復療養(yǎng)中心1檢驗病理科，2全軍腎病中西醫(yī)結(jié)合治療中心病理實驗室，河北 秦皇島066100）

脂肪組織在日常病理工作中非常常見，如脂肪瘤、胃腸道切取的大網(wǎng)膜，乳腺癌周圍以及淋巴結(jié)周圍脂肪組織等。脂肪組織是由大量群集的脂肪細胞構(gòu)成，脂肪細胞間質(zhì)很少，是一種特殊的結(jié)締組織[1]。脂肪組織細胞內(nèi)含有大的脂滴，細胞間缺乏纖維和血管，脂肪組織經(jīng)常規(guī)處理后組織和石蠟不能很好的融合在一起，質(zhì)地松軟，蠟塊在常溫下表面易塌陷，很難制作成一張優(yōu)良的病理切片，給病理閱片、后續(xù)研究帶來一定困難。為了解決這一問題，我們在不影響正常工作、不增加工作時間和工作量的情況下不斷探索，提高了脂肪組織的制片質(zhì)量。

材料與方法

1 脂肪組織的來源

脂肪組織標本主要來源于我院外科手術(shù)標本，如脂肪瘤、多發(fā)性脂肪瘤、胃腸道惡性腫瘤切下的大網(wǎng)膜、乳腺癌乳腺根治標本、淋巴結(jié)周圍的脂肪組織等。

2 試劑與設(shè)備

中性甲醛固定液（中性甲醛液的配制：取10%的甲醛液，加入碳酸鎂至飽和，PH7.6）[2]，95%乙醇，無水乙醇，環(huán)保透明脫蠟液（北京中杉金橋公司），石蠟（上海華永石蠟有限公司，熔點56～58℃），自動組織脫水機（湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司），組織包埋機（天津航天機電有限公司），LEICA-RM2135切片機，烘片機，攤片機，Harris蘇木素染液，伊紅染液等（染液均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司）。

3 脂肪組織取材、固定、脫水、透明、浸蠟

將隨時送檢的脂肪組織標本用取材刀從中間切開，特別大的可以多切兩刀，然后固定于中性甲醛液中，每天上午取材時再將脂肪組織切取為2cm×1cm×0.3cm大小，放入微孔塑料包埋盒中，置自動組織脫水機上固定、脫水、透明、浸蠟，并改良機器各步驟的時間設(shè)置（表1）。

表1 改良前后固定、脫水、透明及浸蠟程序設(shè)定的比較Tab.1 Comparison of the fixation, dehydration, transparency and paraffin immersion process before and after optimization

4 肪組織的包埋

用眼科彎鑷子將脂肪組織從微孔塑料包埋盒中取出，置于組織包埋機工作臺加熱板上，將眼科彎鑷子在酒精燈上烤5s～6s, 然后用彎鑷子在脂肪組織上從左到右從上到下來回輕輕均勻按壓，直至將脂肪組織中的脂滴完全擠出為止（圖1A），將擠壓過的脂肪組織包埋制作成蠟塊。

5 脂肪組織石蠟切片、染色

將包埋好的蠟塊修切好后放在冷臺上或冰箱內(nèi)冷凍幾分鐘，LEICA-RM2135切片機切片，切片厚度5μm, 攤片機水槽內(nèi)溫度38℃～39℃（水槽中勿加酒精），烤片機溫度調(diào)為60℃，將切片先樹立在攤片機旁，待另一張切好后再平放烤片，以此類推，烤片時間15min～20min，常規(guī)蘇木素 、伊紅染色，環(huán)保中性快干膠封片，鏡下觀察。

結(jié) 果

經(jīng)過以上程序和方法處理的脂肪組織蠟塊無塌陷，組織和石蠟能很好的融合在一起，切片完整，無空洞、無擠壓（圖1B）、水槽中展片時蠟帶完整，經(jīng)蘇木素、伊紅染色后鏡下觀察脂肪組織厚薄均勻，結(jié)構(gòu)完整清晰，細胞無擠壓無重疊。形態(tài)清晰，著色均勻（圖2B、2C）。

討 論

脂肪組織石蠟切片往往是技術(shù)人員非常頭痛的事，特別是年輕技術(shù)員，組織經(jīng)過常規(guī)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后質(zhì)地松軟，切片非常困難，易出現(xiàn)空洞，破碎等情況，甚至難以切片，究其原因是脂肪組織本身結(jié)構(gòu)和細胞特性所致。脂肪組織是由大量群集的脂肪細胞構(gòu)成，而脂肪瘤則是由正常脂肪細胞增生而成，脂肪細胞的胞漿內(nèi)含大量脂滴，有機溶劑不易滲透[3]，從而造成組織固定不充分，脫水透明不足，浸蠟滲透不完全等情況出現(xiàn)。當然脂肪組織可以通過長時間的充分固定，延長脫水、透明、浸蠟時間使脂滴完全溶解，石蠟充分滲入脂肪細胞和纖維組織中，由此做出的蠟塊質(zhì)地均勻從而能制作出優(yōu)良的切片，但在病理科的實際工作中沒有充足的時間也不可能將脂肪組織標本挑出來單獨處理，除非是科研需要。

圖1 A，在加熱板上擠壓脂肪組織標本； B，經(jīng)改良方法處理的脂肪組織蠟塊和切片；C，未經(jīng)改良方法處理的脂肪組織蠟塊和切片F(xiàn)ig. 1 A, extruding uniformly the adipose tissue specimen with elbow tweezers on the hot plate; B, the wax blocks and paraffin sections of the adipose tissues treated by improved methods. C, the wax blocks and paraffin sections of the adipose tissues without improved methods

圖2 A，未經(jīng)改良方法處理的脂肪組織的光鏡下觀察；B和C，經(jīng)改良方法處理的脂肪組織的光鏡下觀；比例尺，100μmFig. 2 A, light microscopic view of the adipose tissues without improved methods; B and C, light microscopic view of the adipose tissues with improved methods; scale bar, 100μm

為了在不影響正常工作的情況下做出優(yōu)質(zhì)的脂肪組織切片，本研究中，首先我們采用中性甲醛液作為組織標本的固定液，由于加入了碳酸鎂，pH7.6左右略顯弱堿性，脂肪組織中的脂肪酸為酸性，根據(jù)酸堿中和的原理，以及甲醛具有穿透力強等特點有利于組織的固定。此外，在收到標本時就將標本剖開，從而加強了組織的固定，避免了脂肪瘤因為有完整的包膜，不利于固定液的穿透，影響脂肪組織充分固定的情況。

其次，在有脂肪組織標本時把取材時間提前到上午進行，將脫水機程序設(shè)定為中性甲醛固定液固定6h，95%乙醇Ⅱ2.5h，無水乙醇Ⅲ2.5h，環(huán)保透明液Ⅱ1.5h。由于增加了組織固定、脫水、透明時間，使組織得到充分固定，有利于有機溶劑對脂肪組織中脂滴的溶解，從而增加了組織的硬度，有利于切片。安排在上午取材的好處是不增加工作量，也不影響第2天的包埋切片等其他工作。

通過增加固定時間、延長脫水、透明、浸蠟時間等方法脂肪組織內(nèi)的脂滴減少，對于殘余的脂滴我們在包埋過程中將組織置于組織包埋機工作臺加熱板上，加熱板上溫度足以使脂肪組織內(nèi)的脂滴呈液態(tài)，用眼科彎鑷子在酒精燈上加熱，然后在脂肪組織上輕輕均勻按壓，將脂肪組織中沒有溶解掉的脂滴盡可能擠出。通過按壓可能對脂肪組織的細胞膜造成輕微損傷，脂滴從細胞膜小的裂隙處擠出。脂肪組織中除含有大量的脂滴外還含有不同程度的結(jié)締組織、血管、平滑肌、膠原纖維等[4]，可以造成包埋后的組織硬度不一，若脂肪組織含量少其他組織含量多則切片順利，反之則切片困難。通過按壓可以使整塊脂肪組織變得比較致密結(jié)實[5,6]。按壓不僅擠出了脂滴，也擠出了浸入組織細胞內(nèi)的蠟液，在包埋時由于脂肪組織細胞內(nèi)存在一定的負壓，蠟液通過細胞膜輕微的裂隙進入細胞內(nèi)，細胞膜反彈而恢復細胞原有形態(tài)，脂肪組織經(jīng)過充分的固定、脫水、透明、浸蠟和包埋時的均勻擠壓，增加了脂肪組織的硬度，使組織和石蠟能很好的融合在一起，組織蠟塊質(zhì)地均勻，有利于切出完整的厚薄均勻的石蠟切片，提高了制片質(zhì)量，為病理診斷和后續(xù)研究提供了前提條件。鏡下觀察脂肪組織細胞呈圓形或多邊形，胞質(zhì)由于脂滴被溶解或擠出而呈大的空泡狀，胞核呈扁圓形，位于細胞一側(cè)。經(jīng)多年應用觀察，均勻擠壓組織不會對脂肪組織的鏡下結(jié)構(gòu)造成明顯改變，且能很好的保持抗原，不影響最終的病理診斷。

最后，在切片前我們將制作好的蠟塊放在冷臺上或冰箱內(nèi)冷凍，其目的是進一步增加蠟塊和組織的硬度，在撈片時水槽內(nèi)的溫度控制在38～39℃之間且不加入乙醇。水溫過高組織蠟帶易散，加入乙醇后水面張力增加，組織蠟帶更容易迅速散開，造成無法撈片。

通過一系列方法的改進，我們很好地解決了脂肪組織的制片問題，使包埋后的脂肪組織中很少含有脂滴甚至無脂滴，制作的蠟塊無塌陷（圖1B），切片順利完整，組織結(jié)構(gòu)層次清晰。

總之，作為技術(shù)人員，要認真學習，不斷實踐，勇于創(chuàng)新，把病理技術(shù)工作做精，著名病理學家Karl Lennert 教授曾說“技術(shù)是病理之母”，是推動科學發(fā)展的動力，一張優(yōu)良的脂肪組織切片是病理診斷和科研的前提和基礎(chǔ)[7,8]。熟練掌握脂肪組織的特殊結(jié)構(gòu)，充分的固定，在不影響正常工作，不增加工作量的情況下適當延長組織的脫水、透明、浸蠟時間，盡可能的讓有機溶劑將脂滴溶解，再加上包埋時將脂滴擠出，通過這些方法的改進制作出優(yōu)良的切片。