盧巧梅

(福州大學(xué)測試中心，福州大學(xué)食品安全與生物分析教育部重點(diǎn)實驗室，福建福州 350108)

0 引言

茶葉中的農(nóng)藥等藥物殘留直接影響茶葉品質(zhì)和公眾身心健康.日本、美國等國家對茶葉中農(nóng)藥殘留制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，我國也規(guī)定茶葉中不同種類的農(nóng)藥最大殘留量介于0.01～20 mg·mL－1［1］.因此，亟需一種高通量、高靈敏的農(nóng)殘檢測技術(shù).快速樣品前處理技術(shù)(QuEChERS)［2］利用吸附劑與基質(zhì)中雜質(zhì)相互作用實現(xiàn)除雜凈化目的.該方法操作簡單、回收率高，已被廣泛應(yīng)用于不同農(nóng)產(chǎn)品中藥物殘留的快速分析.液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC－MS/MS)以選擇性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，在多農(nóng)殘檢測中應(yīng)用廣泛［3－6］.四級桿飛行時間質(zhì)譜分辨率高、特異性強(qiáng)［7－8］，并能獲取目標(biāo)物一級和二級質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)，結(jié)合色譜保留時間信息，能更高效地篩查和確證復(fù)雜樣品中痕量組分.實驗基于簡便、快速的QuEChERS前處理，結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜定性準(zhǔn)確和定量靈敏度高的特點(diǎn)，建立檢測久效磷等18種農(nóng)藥殘留的方法體系，高效分析茶葉樣品中的痕量農(nóng)藥殘留，為茶葉的檢測技術(shù)和質(zhì)量安全監(jiān)控提供方法支持.

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

1260系列液相色譜和G6520型四級桿－飛行時間質(zhì)譜儀(美國Agilent公司);QuEChERS試劑盒(美國Agilent公司).

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品由福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院提供.乙腈、甲醇、甲酸和甲酸銨為色譜純(美國Sigmaaldrich公司)，實驗用水為超純水(Milli－Q型超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司).所有試劑使用前經(jīng)過0.22 μm濾膜(上海新亞凈化器件廠)過濾.

不同批次的紅茶(F0116、W4398、W4417)和綠茶(F0036、F0140、F0118)產(chǎn)自福建省安溪縣，由國家茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心提供.

1.2 溶液制備和工作曲線繪制

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備:用甲醇溶液分別將18種農(nóng)藥(久效磷、敵百蟲、磷胺、對氧磷、殺撲磷、嘧菌酯、腈菌唑、三唑磷、丙線磷、苯線磷、殺蟲畏、稻豐散、毒蟲畏、丙環(huán)唑、異丙胺磷、吡唑硫磷、伏殺磷、丙烯菊酯)標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成25 mg·mL－1的單標(biāo)儲備液，再用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 μg·mL－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃避光保存.

工作曲線繪制:將1 μg·mL－1混標(biāo)溶液用甲醇準(zhǔn)確稀釋成一系列質(zhì)量濃度.在最優(yōu)條件下測定，根據(jù)峰面積與相應(yīng)質(zhì)量濃度的關(guān)系繪制工作曲線.

1.3 色譜－質(zhì)譜條件

Hypersil GOLD aQ C18 色譜柱(250 mm×3 mm，i.d.，5 μm; 美國 Thermo Scientific公司); 柱溫 25℃;進(jìn)樣體積10 μL;流動相A為二次水，流動相B為甲醇;流速:0.5 mL·min－1.梯度洗脫程序:0～3 min，60%B;3～8 min，60%～70%B;8～16 min，70%～65%B;16～20 min，65%～70%B;20～21 min，70%B;21～23 min，70%～80%B;23.01 min，60%B，保持7 min.正離子掃描(ESI+);多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);干燥氣溫度325℃;干燥氣流量8 L·min－1;霧化氣壓力241.325 kPa;碎裂電壓135 V.18種農(nóng)藥的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1.

表1 18種農(nóng)藥的質(zhì)譜采集參數(shù)Tab.1 MS acquisition parameters of 18 pesticides

1.4 樣品處理

稱取5.00 g茶粉樣品于50 mL塑料離心管中，分別加入10 mL二次水和10 mL乙腈(含0.1%乙酸(體積分?jǐn)?shù)，下同))，混合均勻，加入Agilent Bond Elut提取試劑盒，快速振蕩2 min，8 000 r·min－1離心3 min.取上清液2 mL，加入Agilent Bond Elut凈化試劑盒，8 000 r·min－1離心3 min，取上清液1 mL，過濾，待測.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

為保證18種物質(zhì)能達(dá)到較好的分離效果，采用單因素實驗法，分別考察流動相組成、流速、柱溫和梯度洗脫程序等因素對色譜分離的影響.重點(diǎn)對流動相方案進(jìn)行優(yōu)化.試驗了甲醇－水、乙腈－水作為流動相對目標(biāo)物分離效果的影響.結(jié)果表明，當(dāng)有機(jī)相為甲醇時，大部分組分的峰形更為尖銳對稱.進(jìn)一步考察水相添加劑(甲酸或甲酸銨)對分離效果

的影響，如圖1所示，水相中加入甲酸或甲酸銨，腈菌唑和三唑磷(8號和9號峰)分離度較差.因此，確定甲醇－水溶液作為流動相，并采用梯度洗脫程序以獲得更好的分離效率.

增大流速能有效提高分離效率，但過高的流速會導(dǎo)致質(zhì)譜離子化效果變差.實驗固定其他條件不變，考察流速 0.3～0.6 mL·min－1對物質(zhì)分離效果的影響.綜合考慮色譜分離度和質(zhì)譜響應(yīng)，最終確定0.5 mL·min－1為最佳流速.考察 25～40 ℃范圍內(nèi)柱溫對分離效果的影響.實驗發(fā)現(xiàn)，柱溫對上述物質(zhì)的總體分離效果影響很弱，故選擇25℃作為分離體系的柱溫.

2.2 質(zhì)譜響應(yīng)情況

圖1 不同流動相對18種農(nóng)殘分離的影響Fig.1 Effects of different mobile phases on separation of 18 pesticide residues

實驗對比了目標(biāo)物在ESI正負(fù)檢測模式下的響應(yīng)情況.鑒于18種農(nóng)藥結(jié)構(gòu)中大多含有N、P等雜原子，易形成［M+H］+、［M+Na］+等加合離子，適合用ESI(+)檢測.其中，嘧菌酯、腈菌唑、三唑磷、丙環(huán)唑等4種物質(zhì)選擇［M+H］+形式定性定量，其他14種物質(zhì)選擇響應(yīng)更強(qiáng)的［M+Na］+形式.丙環(huán)唑可能存在同分異構(gòu)體，在19.56、20.47 min都有較強(qiáng)信號.繼續(xù)考察影響離子化的參數(shù)，最終確定干燥氣溫度325℃;干燥氣流量8 L·min－1;霧化氣壓力241.325 kPa.在上述條件下，18種組分的選擇離子流(EIC)信號見圖2.

2.3 方法驗證

配制一系列質(zhì)量濃度的農(nóng)藥混合溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以各物質(zhì)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.檢測限以3倍信噪比計算，各物質(zhì)的定量分析參數(shù)如表2所示.結(jié)果表明，方法線性關(guān)系良好(R≥0.997 1)，檢測限介于0.50～8.00 ng·mL－1之間.選取10 ng·mL－1進(jìn)行精密度實驗，日內(nèi)和日間的RSDs均小于8.06%(n=5)，表明方法具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性.

圖2 18種農(nóng)殘的最優(yōu)EIC譜圖(出峰序號同圖1)Fig.2 Optimal EIC spectra of 18 pesticide residues(the peak identification were the same as those in Fig.1)

表2 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Tab.2 Equation of linear regression and correlation coefficient

2.4 實際樣品分析

QuEChERS前處理方法基于文獻(xiàn)［9］并加以改進(jìn).考察乙腈、丙酮、乙酸乙酯作為提取劑時目標(biāo)物的回收率.結(jié)果表明，乙腈提取茶葉樣品時，色譜圖雜峰相對較少.繼續(xù)往乙腈中加入0.1%乙酸，樣品的回收率略微提高，故最終選擇乙腈(含0.1%乙酸)作為樣品提取溶劑.茶葉樣品經(jīng)提取凈化后，仍存在一定基質(zhì)干擾，基質(zhì)與1號峰久效磷、18號峰丙烯菊酯的保留時間相當(dāng)接近(見圖3)，但提取精確質(zhì)量顯示，實際樣品均未測得18種化合物.

選擇固定批次的紅茶(W4398)和綠茶(F0036)兩份樣品，分別加入低、中、高(10、80、800 ng·mL－1)3種質(zhì)量濃度的混標(biāo)樣品，計算加標(biāo)樣品的回收率和RSDs值.結(jié)果表明，W4398樣品的加標(biāo)回收率在84.2%～122.3%之間，RSDs值為 0.3%～6.2%;F0036 樣品的加標(biāo)回收率在 95.1%～121.0%之間，RSDs值為 0.6% ～6.1%.

圖3 不同茶葉樣品空白和加標(biāo)的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of blank and spiked tea samples

3 結(jié)語

采用QuEChERS方法結(jié)合高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了不同批次茶葉中多種農(nóng)藥殘留的分析體系.方法定性能力強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，能夠滿足農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的快檢要求.