樊 杰，孫康永杰，魏亞琴，楊宇澤，萬學(xué)瑞，丁巨財(cái)，王 川*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省科學(xué)院生物研究所厭氧微生物中心，甘肅 蘭州730000；3.北京市畜牧總站，北京100101）

腸球菌是一種革蘭陽(yáng)性球菌， 在自然環(huán)境以及人和動(dòng)物消化道內(nèi)廣泛分布，是人和動(dòng)物腸道正常菌群的一部分， 糞腸球菌(Enterococcus faecalis)屬于腸球菌的一種，是人和動(dòng)物腸道內(nèi)主要菌群之一， 能產(chǎn)生細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，抑制大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌的生長(zhǎng)，改善腸道微環(huán)境；同時(shí)其還能抑制腸道內(nèi)產(chǎn)尿素酶細(xì)菌和腐敗菌的繁殖，減少腸道尿素酶和內(nèi)毒素的含量，使血液中氨和內(nèi)毒素的含量下降[1]；另一方面當(dāng)其侵入其他部位（如口腔、尿道、乳房等）會(huì)造成牙髓根尖周病、尿路感染、乳房炎等多種疾病。臨床實(shí)驗(yàn)研究已發(fā)現(xiàn)，在乳房炎患牛乳房組織及分泌乳汁中能夠分離得到糞腸球菌[2]。TODHUNTE 等發(fā)現(xiàn)在干乳期奶牛乳房疾病的病原微生物中糞腸球菌的比例達(dá)22.5%-70.4%[3]。esp（Enterococcus surface protein）基因的全長(zhǎng)5791 bp，結(jié)構(gòu)獨(dú)特，核心區(qū)域由多個(gè)堿基序列重復(fù)組合而成，由其編碼表達(dá)的糞腸球菌表面蛋白是一種黏附素，這是腸球菌眾多致病因素之一，其在腸球菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附定植和逃避宿主免疫清除方面起到一定作用[4]。本實(shí)驗(yàn)室前期在大腸埃希氏菌BL21 中表達(dá)了部分牛源糞腸球菌表面蛋白ESP，利用生物信息學(xué)軟件分析其編碼氨基酸的基本理化性質(zhì)[5]。目前檢測(cè)糞腸球菌的方法有比較傳統(tǒng)的革蘭氏染色法、細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)檢等；也可通過間接ELISA 方法對(duì)豬源糞腸球菌Ace 蛋白進(jìn)行檢測(cè)[6]；PCR 方法檢測(cè)豬源糞腸球菌的16S rDNA[7]；用基于TaqMan 探針的熒光定量PCR 方法檢測(cè)糞腸球菌的d- 丙氨酸聚連接酶(ddl)基因[8]；基于熒光定量PCR 方法檢測(cè)水中活性糞腸球菌23S rRNA 拷貝數(shù)而確定糞腸球菌含量[9]。還可采用MALDI-TOF MS (Matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry， 基 質(zhì)輔助激光解吸電離- 飛行時(shí)間質(zhì)譜)方法對(duì)豬源糞腸球菌進(jìn)行快速鑒定及同源性分析[10]； 以及建立針對(duì)16SrRNA序列的基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)， 鑒定人體腸道致病糞腸球菌[11]。其中傳統(tǒng)的檢測(cè)方法特異性差，且耗時(shí)較長(zhǎng)，不符合快速檢測(cè)的要求；MALDI-TOF MS 鑒定法和基因芯片技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器要求較高。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，是快速檢測(cè)病原微生物的首選方法。目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測(cè)牛源糞腸球菌處于空白狀態(tài)。因此本項(xiàng)目建立了牛源糞腸球菌esp基因熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線， 用于SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法快速檢測(cè)牛源糞腸球菌。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

牛源糞腸球菌為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

用LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)牛源糞腸球菌。

1.1.3 主要試劑和儀器

質(zhì)粒 DNA 提取試劑盒、ChamqTM Universal SYBRQpcr Master Mix、DL2000 Plus DNA Maker(Vazyme)、膠回收試劑盒（ABigen）、IPTG、Amp、X-Gal（北京全式金生物技術(shù)有限公司）、其他試劑（國(guó)產(chǎn)分析純）。電熱恒溫培養(yǎng)箱（南京電器三廠）、恒溫震蕩器（上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司，ZHWY-200D）、離心機(jī)（eppendorf）、PCR 儀（Eppendorf，Mastercycler nexus GSX1）、凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD）、金屬?。ê贾輮W盛儀器有限公司，MK-20）、核酸蛋白檢測(cè)儀（GeneQuant 1300）、 熒光定量 PCR儀（Roche，LightCyclerR96）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

參照糞腸球菌esp 基因在Genbank 中的序列 （序列號(hào)為AF034779）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并送到金唯智生物科技有限公司合成。引物序列如下表：

表1 引物設(shè)計(jì)

1.2.2 法提取糞腸球菌基因組

采用CATB 法對(duì)糞腸球菌基因組DNA 提取，電泳檢測(cè)合格后所得基因組于-18℃保存。

1.2.3 梯度PCR 確定引物退火溫度

總反應(yīng)體積為15 μL，上下游引物各0.6 μL，Taq 酶7.5 μL，dd 水，基因組模板1.8μL，進(jìn)行梯度PCR︰94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃30 s；50～60 ℃30 s；72 ℃30 s；共35個(gè)循環(huán)，采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.4 esp 基因50μL 反應(yīng)體系PCR

引物退火溫度確定后采用50 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR， 上下游引物各2 μL，Taq 酶25 μL，ddH2O 18 μL，基因組模板3 μL， 反應(yīng)程序︰94℃預(yù)變性5 min；94 ℃30s；58 ℃30 s；72 ℃30 s；共35 個(gè)循環(huán)。采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.5 重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的制備及鑒定

依照膠回收試劑盒說明進(jìn)行esp 回收， 并于-20 ℃保存，采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收結(jié)果。將esp基因連接到對(duì)電泳得到的目的條帶進(jìn)行膠回收，將回收產(chǎn)物與pMD18-T 載體于16 ℃恒溫金屬浴連接過夜； 將得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌TOP10 感受態(tài)細(xì)胞中加入LB 液體培養(yǎng)基活化1 h，低速離心后涂于Amp+、XGal和IPTG 處理的LB 瓊脂平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落白斑， 在含有Amp 的LB 液體培養(yǎng)基37 ℃、200 r/min 振蕩過夜培養(yǎng)。采用菌液PCR 檢測(cè)esp 基因是否連接到載體質(zhì)粒上。依照質(zhì)粒提取試劑盒說明提取質(zhì)粒，并于-20 ℃保存。采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒提取結(jié)果。取15 μL 提取的質(zhì)粒送到擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果用Megalign 軟件分析。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定陽(yáng)性重組質(zhì)粒的OD 值， 計(jì)算出拷貝數(shù)， 將重組質(zhì)粒進(jìn)行10 倍系列稀釋[12]。

1.2.6 熒光定量PCR

反應(yīng)總體積為25 μL， 其中上下游引物各0.8 μL，2×SuperReal PreMix12.5 μL，ddH2O 9.9 μL， 質(zhì)粒模板1 μL。反應(yīng)條件︰95℃預(yù)變性1 min；95 ℃5 s；58 ℃10 s；72 ℃20 s；共35 個(gè)循環(huán)。在延伸階段進(jìn)行熒光信號(hào)收集，反應(yīng)結(jié)束后，使用軟件Qrigin 2018 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果

2.1 菌液PCR 及陽(yáng)性質(zhì)粒驗(yàn)證

菌液PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小為120bp，與預(yù)期結(jié)果相符。（見圖1）。陽(yáng)性質(zhì)粒驗(yàn)證結(jié)果也符合要求。測(cè)序結(jié)果表明重組質(zhì)粒中含有esp 基因的核苷酸序列。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCResp 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 菌液PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物及陽(yáng)性質(zhì)粒驗(yàn)證

2.2.1 動(dòng)力學(xué)曲線與熔解曲線

經(jīng)Lightcycler 96 分析后發(fā)現(xiàn)， 熔解曲線峰值單一，擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度值非常均一，為81.9 ℃，說明產(chǎn)物擴(kuò)增具有特異性。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR esp 重組質(zhì)粒DNA 動(dòng)力學(xué)曲線與熔解曲線

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按上述的優(yōu)化條件， 取109、108、107、106、105、104、103拷貝/μL 的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，分別進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示該標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)的靈敏度為109-103個(gè)模板;通過對(duì)其回歸曲線進(jìn)行分析， 發(fā)現(xiàn)其相關(guān)性良好， 相關(guān)系數(shù)r2=0.9998。系統(tǒng)生成的回歸方程為：y=-0.29981x+11.742(見圖3)。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR esp 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析，實(shí)現(xiàn)了PCR 技術(shù)從定性到定量的飛躍。該技術(shù)具有敏感性高、重復(fù)性好、快速、操作簡(jiǎn)便、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和無污染等優(yōu)點(diǎn)[13]。本研究首次采用SYBR Green Ⅰ法檢測(cè)牛源糞腸球菌esp 基因。對(duì)于導(dǎo)致糞腸球菌毒力因子esp 的檢測(cè)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法的靈敏度比普通的兩步法RT- PCR 高100 倍[14]；比普通的檢測(cè)方法如生化實(shí)驗(yàn)、革蘭氏染色鑒定特異性更強(qiáng)；而豬源糞腸球菌Ace 蛋白間接ELISA 實(shí)驗(yàn)是對(duì)Ace 蛋白基因構(gòu)建原核表達(dá)載體，成功表達(dá)并純化重組蛋白，以重組蛋白為抗原建立檢測(cè)糞腸球菌特定基因的方法，由此可見，此方法比實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法復(fù)雜得多， 后者不需要進(jìn)行蛋白的表達(dá)[6]； 基于TaqMan 探針的熒光定量PCR 方法則需要設(shè)計(jì)特異性的基因探針；RT-qPCR 方法需要進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 操作難度大。MALDI-TOF MS 鑒定法、基因芯片技術(shù)所需實(shí)驗(yàn)儀器比較昂貴，且操作難度大。本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)esp 基因的特異性引物，并且調(diào)節(jié)引物與模板濃度、退火溫度來優(yōu)化兩基因同時(shí)擴(kuò)增的反應(yīng)條件，減少假陽(yáng)性的存在，并以不同濃度重組質(zhì)粒DNA 分別進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)起始濃度越高，Ct 值越小，即起始模板濃度與Ct 值之間呈良好的線性關(guān)系。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct 值， 即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。本研究中，通過10 倍系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度所得到的Ct 值繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.9998，能夠保證數(shù)據(jù)的精確性。根據(jù)回歸方程，可直接計(jì)算出各樣品模板的初始含量。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了esp 標(biāo)準(zhǔn)曲線，為牛源糞腸球菌快速檢測(cè)和進(jìn)一步測(cè)定esp基因的表達(dá)量奠定了基礎(chǔ)。