王欣榮，張琪月

（河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，河北保定071000）

口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的豬、牛、羊等主要家畜和其它家養(yǎng)、野生偶蹄動物共患的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，易感動物達70 多種。 該病傳播途徑多、速度快，曾多次在世界范圍內(nèi)爆發(fā)流行，被WHO(世界衛(wèi)生組織）列為A 類傳染病，被我國列為一類動物疫病。 家畜感染口蹄疫尚無有效治療方法，只能通過疫苗接種進行預防?？谔阋咭呙缰两褚延?0多年的發(fā)展歷史，目前口蹄疫疫苗正在向提高免疫效率、減少動物接種副反應、改善疫苗安全性的方向發(fā)展。

疫苗成分為VLP 生理鹽水（口蹄疫病毒樣顆粒）+佐劑（法國賽比克佐劑251C,機制：通過改變抗原的物理性狀， 使抗原在體內(nèi)的保存時間增長，刺激單核吞噬細胞對抗原的呈遞能力，促進淋巴細胞分化，增強機體的免疫應答）。 文章將介紹對注射了口蹄疫病毒樣顆粒疫苗的SPF（specific pathogen free,SPF） 小鼠的免疫功能的影響來證明疫苗的效果。

1 材料

SPF 級BALB/c 小鼠，牛肉膏，蛋白胨，氯化鈉，磷酸氫二鉀，0.1mol/L 氫氧化鈉，可溶性淀粉，PBS，瑞氏染液，番瀉苷B，白葡萄球菌培養(yǎng)液，小牛血清，RRBC 懸液，補體

2 方法

2.1 腹腔巨噬細胞吞噬實驗 巨噬細胞可以吞噬較大顆粒性異物， 如將雞紅細胞注入小鼠腹腔，腹腔巨噬細胞將會吞噬雞紅細胞，并進一步將其消化，本試驗采用小鼠腹腔內(nèi)注入白葡萄球菌法檢測巨噬細胞的吞噬功能。 此實驗于免疫六天后進行，實驗組6 組其中3 組小鼠注射番瀉苷B，3 組小鼠不注射番瀉苷B， 對照組2 組中二組注射番瀉苷B， 一組不注射番瀉苷B。 試驗前三天，于IVC 動物房內(nèi)給小鼠腹腔注射可溶性淀粉肉湯，每只2 ml（由于直接收集小鼠腹腔巨噬細胞的數(shù)量較少，因此通常先于小鼠腹腔內(nèi)注射刺激劑，誘導巨噬細胞滲出、聚集，然后收集腹腔滲出液中的巨噬細胞）。 試驗時于小鼠腹腔注射白葡萄球菌培養(yǎng)液每只1 ml,并輕揉腹部，使腹腔內(nèi)液體和白葡萄球菌培養(yǎng)液充分混合。 注射后30 min,于小鼠腹腔注射生理鹽水5 ml/只，并輕揉腹部數(shù)次(10 min)。 用頸椎脫臼法處死小鼠，用75%酒精對腹部皮膚消毒，用移液槍(20μl～200μl)吸出小鼠腹腔液，注于冰盒內(nèi)的離心管中，離心,棄上清，最多留下0.5 ml 巨噬細胞懸液，制備細胞涂片觀察。

2.2 溶血空斑實驗 溶血空斑實驗是體外檢測B淋巴細胞產(chǎn)生抗體能力的一種方法，此實驗于免疫三周后進行，取RRBC 懸液，稀釋到4×10^8 個/ml， 每只小鼠腹腔注射1ml， 在用RRBC 免疫4天后，用頸椎脫臼法處死小鼠，用75%的酒精浸泡小鼠5 分鐘， 用紗布吸干小鼠體表的酒精，置于超凈臺內(nèi)，嚴格按照無菌操作的要求（分別用兩把滅菌的手術(shù)剪剪開皮膚和腹壁肌肉及腹膜）取出脾，用PBS 液漂洗一次后，放入含有10%小牛血清PBS 液的平皿中， 用2.5ml 注射器吹打脾臟，制備單細胞懸液，在冰浴中用PBS 液洗兩次，均作離心處理，轉(zhuǎn)速為1500r/min，離心5 min，調(diào)整脾細胞數(shù)為1×10^7 個/ml。制備底層和頂層瓊脂，底層瓊脂：1.4%瓊脂（用PBS 配置的1.4%的瓊脂糖）， 頂層瓊脂：0.7%瓊脂 （用PBS 配置的1.4%的瓊脂糖）。 將制作好的平皿置于溫箱中孵育一小時后取出加入補體， 再孵育二十四小時，觀察結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 腹腔巨噬細胞吞噬試驗 鏡下可見巨噬細胞核呈藍色，被吞噬的白葡萄球菌呈堆聚葡萄串狀。 分別計算吞噬率和吞噬指數(shù)。

吞噬率=吞噬白葡萄球菌的巨噬細胞總數(shù)/巨噬細胞數(shù)×100%

吞噬指數(shù)=被吞噬的白葡萄球菌總數(shù)/巨噬細胞數(shù)

3.2 溶血空斑實驗

表一

表二

4 討論

由表一中注射番瀉苷B 的二組及六、 七、八組數(shù)據(jù)可以看出，免疫組小鼠巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)明顯降低，表明番瀉苷B 通過與清道夫受體結(jié)合從而對巨噬細胞識別病原微生物、異物等具有明顯的抑制作用；由未注射番瀉苷B 的一組及三、五組數(shù)據(jù)可以看出，免疫組小鼠巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)明顯升高，即免疫組小鼠巨噬細胞吞噬能力強于未免疫組小鼠，表明免疫組小鼠機體天然免疫能力有所提高。

由表二中數(shù)據(jù)可以看出實驗組的空斑數(shù)、空斑形成率明顯高于對照組， 即經(jīng)過免疫的小鼠B淋巴細胞產(chǎn)生抗體的數(shù)量及產(chǎn)生抗體的能力均高于未免疫的小鼠，表明免疫組小鼠B 淋巴細胞產(chǎn)生抗體能力增強。

通過以上的實驗，我們可以看出口蹄疫病毒樣顆粒疫苗可以增強機體天然免疫應答能力以及產(chǎn)生抗體能力等等方面使得機體的免疫功能增強，這為防治口蹄疫做出來極大的貢獻。 此方法可廣泛用于獸藥的篩選與臨床治療效果評價。通過實驗我們更近一步的了解了該疫苗的作用，我們應該通過更多的實驗來探索它其他的作用。