嚴 國，梅光明*，常家琪，張小軍，顧 捷，孟春英

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316021；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021；3.浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江 舟山 316021）

砷（As）是自然界中廣泛分布的一種重要的類金屬元素，可與肌體細胞中的酶結(jié)合，使許多酶失活，造成代謝障礙[1]。自然界中的砷元素通常由地表徑流等方式進入海水中，又通過食物鏈在海產(chǎn)品富集，因此海產(chǎn)品攝入成為人體暴露砷元素的主要途徑之一[2-3]。海產(chǎn)品中的砷分為無機砷和有機砷兩大類，其中無機砷主要指砷酸根（arsenate，As（V））和亞砷酸根（arsenite，As（III）），有機砷主要指一甲基砷（monomethyl arsenic acid，MMA）、二甲基砷（dimethyl arsenic acid，DMA）、砷甜菜堿（arsenobetaine，AsB）、砷膽堿（arsenocholine，AsC）、砷糖和砷脂等[4]。砷的生物毒性不僅與其總含量相關(guān)，更大程度上與其存在的形態(tài)種類相關(guān)[5]，以半致死量（LD50）計，毒性依次為As（III）＞As（V）＞MMA＞DMA＞AsB＞AsC[6-7]。無機砷是砷元素化合物致畸、致癌及致突變的主要來源，有機砷通常被認為是低毒或者無毒的，海產(chǎn)品中砷化合物的含量較高，但主要以無毒或低毒的AsB和砷糖的形式存在[4]。

目前砷形態(tài)分析的方法主要有高效液相色譜-原子熒光光譜（high performance liquid chromatography-atomic fluorescence spectrometry，HPLC-AFS）法[8-10]、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry，HPLC-ICP-MS）法[11-14]以及毛細管電泳-ICP-MS法[15-17]等。HPLC-ICP-MS因結(jié)合了HPLC的高效分離性能和ICP-MS的超強元素分析能力，具有線性范圍寬、檢出限低、靈敏度高且干擾少等優(yōu)點，已成為目前砷形態(tài)分析最有力的方法，廣泛應(yīng)用于食品[3,14,18-19]、藥品[20-21]、環(huán)境[22-23]中砷化合物的測定。GB 5009.11—2014《食品中總砷及無機砷的測定》[24]中第一法HPLC-AFS法最多只能測定As（III）、As（V）、MMA和DMA這4 種砷形態(tài)分析物，不能測定AsB等（因其無法轉(zhuǎn)化成含砷的氣態(tài)氫化物而被AFS測定）。該標(biāo)準中的第二法使用HPLC-ICP-MS測定了5 種砷形態(tài)，但在實際樣品中也很難將AsB和DMA分開，嚴重影響二者定性和定量準確性要求。海蟹因具有味道鮮美、低脂肪、高蛋白等優(yōu)點，深受消費者喜愛，但同時作為一種營養(yǎng)級別較高的甲殼類海產(chǎn)生物，其富集砷元素能力較強，已有文獻中有關(guān)不同品種海蟹及蟹體不同組織中砷元素的分布特征的研究報道較少。本實驗運用優(yōu)化后的ICP-MS法對4 種海蟹（青蟹、三疣梭子蟹、日本鱘和細點圓趾蟹）及其不同組織（蟹肌肉、蟹鉗肉、蟹鰓、肝胰腺和性腺）中的砷元素分布特征進行測定，為海蟹砷污染風(fēng)險評估及消費者食用建議提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青蟹、三疣梭子蟹、日本鱘和細點圓趾蟹均購于浙江省舟山市超市或集貿(mào)市場，按照GB/T 30891—2014《水產(chǎn)品抽樣規(guī)范》[25]處理后作為待測樣品。

AsB溶液標(biāo)準物質(zhì)（GBW 08670）、MMA溶液標(biāo)準物質(zhì)（GBW 08668）、DMA溶液標(biāo)準物質(zhì)（GBW 08669）、As（V）溶液標(biāo)準物質(zhì)（GBW 08667）、As（III）溶液標(biāo)準物質(zhì)（GBW 08666） 中國計量科學(xué)研究院；砷單元素標(biāo)準溶液（1 000 μg/mL，GSB04-1714-2004） 國家有色金屬及電子材料分析測試中心；扇貝粉（GBW10023）和紫菜粉（GBW10050）生物成分分析標(biāo)準物質(zhì) 地球物理地球化學(xué)勘查研究所；金槍魚組織中砷形態(tài)標(biāo)準物質(zhì)（BCR-627） 歐洲標(biāo)準局。

(NH4)2CO3、NH4H2PO4、(NH4)2HPO4（均為色譜純）德國Sigma公司；甲醇、正己烷（均為色譜純） 德國Merck公司；硝酸（優(yōu)級純） 美國J.T.Baker公司；過氧化氫、氨水（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；質(zhì)譜調(diào)諧液（10 μg/L Ce、Co、Li、Tl、Y）、內(nèi)標(biāo)液（100 μg/mL Bi、Ge、In、Li、Lu、Rh）美國Agilent公司；實驗用水為Milli-Q制備超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

AcquityTMH-class超高效液相色譜儀 美國Waters公司；7900型ICP-MS儀 美國Agilent公司；Centrifuge 5810高速離心機 德國Eppendorf公司；MS2旋渦混合器德國IK公司；AL204型電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；超聲清洗機 寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司；pH計 德國Sartorius公司；ETHOS 1型微波消解儀 意大利Milestone公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

砷形態(tài)物標(biāo)準儲備溶液：將5 種不同形態(tài)砷（AsB、MMA、DMA、As（III）、As（V））的標(biāo)準物質(zhì)溶液取適量分別準確轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，用超純水分別定容至5 mL，其質(zhì)量濃度分別為14.72、9.54、22.17、28.78、6.88 μg/mL，于4 ℃避光保存，備用。

砷形態(tài)物混合標(biāo)準使用液：分別準確移取5 種不同形態(tài)砷（AsB、MMA、DMA、As（III）、As（V））的標(biāo)準儲備溶液340、524、226、174、727 μL于5 mL容量瓶中，用超純水容至5 mL，使各組分質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

砷形態(tài)標(biāo)準曲線系列：分別準確移取砷形態(tài)物混合標(biāo)準使用溶液50、100、250、500 μL用流動相定容至5 mL，使標(biāo)準溶液質(zhì)量濃度為10、20、50、100 μg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

砷單元素標(biāo)準曲線系列溶液：將1 000 μg/L砷單元素標(biāo)準溶液用1%硝酸溶液逐級稀釋到1.0、5.0、10.0、30.0、50.0、100.0、300 μg/L，超純水定容至5 mL備用。

硝酸溶液（0.15 mol/L）：準確量取10 mL硝酸，溶于水并稀釋至1 000 mL。

(NH4)2CO3溶液（50 mmol/L）：稱取2.450 3 g（精確至0.000 1 g）(NH4)2CO3，溶于500 mL水中，用氨水調(diào)節(jié)pH 9.5，經(jīng)0.45 μm水相濾膜過濾后超聲脫氣30 min，備用。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 總砷測定前處理

準確稱量0.5 g（精確至0.000 1 g）均質(zhì)后的待測螃蟹樣品于聚四氟乙烯消解罐中，依次加入6.0 mL硝酸、2.0 mL過氧化氫溶液，搖勻后加蓋放置過夜，使樣品進行預(yù)消解。次日將消解罐放入微波消解系統(tǒng)中，設(shè)置適宜的微波消解程序（表1），按照相關(guān)消解步驟進行消解。消解完畢后，180 ℃于趕酸架上加熱趕酸至1～2 mL，冷卻至室溫后用超純水定容至50 mL，采用ICP-MS上機測定。同時做試劑空白實驗，采用扇貝粉和紫菜粉作為質(zhì)控樣進行結(jié)果質(zhì)量控制。

表1 微波消解程序Table 1 Microwave digestion procedure

1.3.2.2 砷形態(tài)前處理

準確稱量均質(zhì)后的待測樣品0.5～1.0 g（精確至0.000 1 g）于50 mL離心管中，加入20 mL 0.15 mol/L硝酸溶液，3 000 r/min渦旋1 min，置于氣浴恒溫振蕩器中，在50 ℃、150 r/min過夜振蕩提取，提取完畢后次日取出，冷卻至室溫，3 000 r/min渦旋30 s，6 000 r/min離心8 min。移取5 mL上清液于15 mL離心管中，加入正己烷3 mL，3 000 r/min渦旋1 min后再6 000 r/min離心8 min，棄去正己烷層。吸取下層清液，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾后上HPLC-ICP-MS分析。按相同操作方法做試劑空白實驗，同時檢測BCR-627標(biāo)準物質(zhì)進行結(jié)果質(zhì)量控制。

1.3.3 方法

1.3.3.1 總砷含量測定

表2 ICP-MS工作參數(shù)Table 2 Working parameters of ICP-MS

使用1.0 μg/L Ce、Co、Li、Tl、Y的調(diào)諧液在線優(yōu)化ICP-MS各項參數(shù)，使分辨率和靈敏度等各項儀器性能達到最佳?？偵楹繙y定時采用1.0 μg/mL89Y溶液在線加入內(nèi)標(biāo)，用于校正儀器響應(yīng)信號強度的變化。優(yōu)化后ICPMS的主要參數(shù)見表2。將砷元素標(biāo)準曲線系列溶液從低濃度到高濃度依次于ICP-MS中進樣，測定相應(yīng)的信號值。以標(biāo)準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、信號強度（CPS計數(shù)）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線，外標(biāo)法定量，測定4 種海蟹及其不同部位中總砷含量。

1.3.3.2 砷形態(tài)測定

色譜條件：Dionex IonPac As19陰離子交換柱（250 mm×4 mm，10 μm）及保護柱（50 mm×4 mm）；進樣量50 μL；樣品室溫度10 ℃，柱溫40 ℃；流動相為50 mmol/L、pH 9.5的(NH4)2CO3溶液；等度洗脫；流速1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：瞬時信號采集模式，其他參數(shù)見表2所示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Origin 9.1和Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進行處理并作圖，實驗數(shù)據(jù)取平行實驗的均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 總砷含量測定

選用GBW10050紫菜粉和GBW10023扇貝粉作為質(zhì)控樣品進行總砷測定的結(jié)果質(zhì)量控制，質(zhì)控樣標(biāo)準值、測定值和相對標(biāo)準偏差見表3。結(jié)果顯示2 種質(zhì)控樣品的總砷測定值都在標(biāo)準值范圍內(nèi)，說明采用的ICP-MS測定方法準確度高、精密度好。

表4為4 種海蟹及其不同組織中總砷含量的測定結(jié)果：從平均值進行比較，除蟹腮、殼后的整蟹中總砷測定值依次為細點圓趾蟹（4.75 mg/kg）＜青蟹（6.18 mg/kg）＜三疣梭子蟹（10.52 mg/kg）＜日本鱘（16.80 mg/kg）；同一品種的海蟹分組織部位來看，總砷含量均值基本都呈現(xiàn)出性腺（雌）＞肝胰腺＞蟹胸肌肉＞蟹鉗肉＞蟹鰓的變化趨勢。后續(xù)進一步對來自同一個樣品的分部位總砷測定值進行分析，也呈現(xiàn)出同樣的規(guī)律。結(jié)果表明海蟹是高富集砷海洋生物，性腺和肝胰腺是海蟹富集砷的主要部位。我國國家標(biāo)準規(guī)定水產(chǎn)動物及其制品（魚類及制品除外）無機砷含量小于0.5 mg/kg[26]，158 個海蟹總砷含量為0.37～35.81 mg/kg，因此有必要對海蟹中砷進行形態(tài)分析。

表4 4 種海蟹及其組織中總砷含量的測定Table 4 Determination of total arsenic in four sea crabs

2.2 海蟹中砷形態(tài)測定條件優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1.1 色譜柱的選擇

分別采用Waters SpherisorbSAX色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Hamilton PRP-X100陰離子交換柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）和Dionex IonPac As19陰離子交換柱（250 mm×4 mm，10 μm）對20 μg/L的6 種砷化合物的混合標(biāo)準溶液進行分離。在嘗試多種流動相組成和梯度洗脫程序下，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Waters SpherisorbSAX色譜柱分離出現(xiàn)干擾峰多且目標(biāo)物響應(yīng)值均較低（圖1A）；使用Hamilton色譜柱進行分離發(fā)現(xiàn)，AsB和As（III）不能很好分離（圖1B）；Dionex IonPac As19對AsC和AsB不能達到基線分離（圖1C）。3 種色譜柱都很難實現(xiàn)6 種砷形態(tài)物的色譜峰完全分離。已有較多的文獻表明水產(chǎn)品中砷元素多以AsB存在和少量的無機砷存在，AsC基本未檢出，并且因無機砷毒性最強，As（III）、As（V）是水產(chǎn)品中必檢參數(shù)，因此水產(chǎn)品砷元素形態(tài)分析檢測中必須實現(xiàn)AsB和無機砷的分離。因此最終選擇AsB、MMA、DMA、As（III）、As（V）這5 種砷形態(tài)為研究對象，采用Dionex IonPac As19色譜柱在6 min內(nèi)將5 種砷形態(tài)完全分開（圖2），且峰形尖銳，響應(yīng)值高，用時短且分離效果好。

圖1 不同色譜柱分離6 種砷形態(tài)色譜圖Fig. 1 Chromatograms of six arsenic species on different columns

圖2 Dionex IonPac As19色譜柱分離5 種砷形態(tài)色譜圖Fig. 2 Chromatograms of five arsenic species on Dionex IonPac As19 column

2.2.1.2 流動相的選擇

在選定的Dionex IonPac As19色譜柱下，實驗對比表5中常用的5 種流動相對5 種砷形態(tài)的洗脫效果。結(jié)果顯示，序號4中流動相為pH 6.0的25 mmol/L NH4H2PO4溶液時，AsB不能得到有效洗脫，且和DMA不能完全分離；序號1、2、3、5洗脫條件下，5 種不同砷形態(tài)化合物均能洗脫分離，但序號2條件下，分離效果最好，且使用等度洗脫條件，可以減少梯度洗脫需要的柱平衡時間，提高分析速度，6 min內(nèi)5 種砷形態(tài)化合物全部洗脫且完全分離（圖2）。通過單標(biāo)定性，5 種不同化合物洗脫順序依次為AsB、DMA、As（III）、MMA、As（V）。

表5 洗脫條件的選擇Table 5 Gradient elution program of mobile phase

2.2.1.3 樣品提取劑的選擇

目前，常見的樣品中砷形態(tài)提取劑有水、甲醇-水（1∶1，V/V）、0.15 mol/L硝酸溶液、20 mmol/L乙酸銨溶液等。水作為提取劑時一般對基質(zhì)簡單的樣品進行提取，如大米等。甲醇-水為提取劑時，能夠較好避免形態(tài)間的轉(zhuǎn)化，使化合物保持自身形態(tài)[27-28]，但甲醇含量過高時會降低無機砷的提取效率和樣品測定時的靈敏度，且有機相中的碳易在ICP-MS截取錐孔處富集堆積縮短錐使用壽命和影響測定結(jié)果[3]。以HPLC-ICP-MS法測定的BCR-627金槍魚標(biāo)準物質(zhì)中的AsB、DMA含量與質(zhì)控樣標(biāo)準值的比值作為提取率來比較上述4 種溶劑的提取效果。如圖3所示，采用0.15 mol/L硝酸溶液和20 mmol/L乙酸銨溶液作為提取劑，對AsB和DMA的提取率最好，均大于70%，且0.15 mol/L硝酸溶液提取效率最佳，AsB、DMA平均提取率分別為89.7%和83%，因此選擇0.15 mol/L硝酸溶液作為海蟹樣品中砷形態(tài)測定的提取劑。

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.2.1 質(zhì)譜檢測模式的選擇

實驗考察No Gas標(biāo)準模式和He模式下，5 種砷化合物分析的響應(yīng)值。結(jié)果表明在No Gas標(biāo)準模式下，每種砷化合物響應(yīng)均是He模式的20 倍左右，且沒有出現(xiàn)目標(biāo)物干擾峰（圖4）。陳紹占等[20]在分析牛黃解毒片暴露后大鼠血清中砷形態(tài)時，也同樣對兩種模式下5 種砷形態(tài)化合物檢出限高低以及對40Ar35Cl＋、75As檢測信號的影響發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準模式下檢出限較低且標(biāo)準模式下產(chǎn)生的干擾峰不影響5 種砷化合物的測定。因此本實驗選擇標(biāo)準模式進行5 種砷形態(tài)化合物的檢測。

圖4 質(zhì)譜檢測模式對砷形態(tài)物測定響應(yīng)信號強度的影響Fig. 4 Effect of mass spectrometric test mode (He collision and No Gas mode) on signal response of arsenic species

2.2.2.2 補償氣流量的選擇

在使用標(biāo)準模式下，進一步考察載氣流量和補償氣流量的最適值（圖5），結(jié)果表明當(dāng)載氣流量為1.05 mL/min，補償氣為0 mL/min時，響應(yīng)最高。陸奕娜等[29]對海產(chǎn)品中砷形態(tài)化合物測定時發(fā)現(xiàn)，補償氣為0 mL/min時，儀器靈敏度最佳且對雙電荷及氧化物的干擾最小，本實驗選擇不使用補償氣。

圖5 No Gas模式下Ar流速對砷形態(tài)物測定響應(yīng)信號強度的影響Fig. 5 Effect of Ar velocity on signal response of arsenic species in No Gas mode

2.3 砷形態(tài)方法學(xué)驗證

2.3.1 方法檢出限及線性范圍

分別配制0、10、20、50、100、300 μg/L系列砷化合物混合標(biāo)準溶液，在上述優(yōu)化后的一系列實驗條件下進行分析。結(jié)果表明在0～300 μg/L范圍內(nèi)，5 種砷化物的響應(yīng)色譜峰面積值與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.998。以實際樣品測定后計算色譜圖中各目標(biāo)物的峰響應(yīng)信噪比（RSN），得出各砷形態(tài)物的檢出限（RSN=3）為0.008～0.014 mg/kg，定量限（RSN=10）為0.025～0.055 mg/kg（表6）。

表6 測定曲線線性關(guān)系及方法檢出限與定量限Table 6 Calibration equations, LODs and LOQs for arsenic species

2.3.2 方法的準確度和精密度驗證

準確稱量BCR-627金槍魚組織中砷形態(tài)標(biāo)準物質(zhì)0.5 g，其中含AsB參考值為（3.9±0.225）mg/kg，DMA含量參考值為（0.15±0.022 5）mg/kg。按照本實驗方法進行的6 次平行測定結(jié)果為：AsB含量范圍為3.794～4.056 mg/kg，DMA測定值范圍為0.132 8～0.167 4 mg/kg，相對標(biāo)準偏差分別為4.2%和4.6%，均在參考值范圍內(nèi)。同時采用加標(biāo)回收率實驗進一步驗證本方法的準確度和精密度。準確稱取青蟹肌肉樣品18 份，分別添加3 種不同質(zhì)量濃度的AsB、DMA、MMA、As（III）、As（V）5 種砷化合物混合標(biāo)準溶液，使得樣品添加量分別為0.40、1.00、2.00 mg/kg，每個梯度下設(shè)置6 個平行實驗，進行加標(biāo)回收實驗，計算添加回收率和相對標(biāo)準偏差，同時做樣品本底值測定。如表7所示，在高、中、低3 個加標(biāo)水平下，5 種不同砷形態(tài)物加標(biāo)回收率在70.0%～105.0%之間，相對標(biāo)準偏差均小于5%，滿足分析檢測要求，進一步證實了本方法測定結(jié)果準確性好、精密度高。

表7 青蟹肌肉樣品中5 種砷形態(tài)物的添加回收率測定（n=6）Table 7 Spike recoveries of five arsenic species in muscle of Scylla serrata (n= 6)

2.3.3 海蟹樣品中砷形態(tài)分析

圖6 青蟹肌肉中5 種砷化合物色譜圖Fig. 6 Chromatograms of five arsenic species in muscle of S. serrata

表8 4 種海蟹及其組織中砷化合物測定結(jié)果Table 8 Average concentrations of total arsenic and arsenic species in whole sea crabs and their tissues

運用HPLC-ICP-MS法測定4 種海蟹（青蟹、細點圓趾蟹、三疣梭子蟹和日本鱘）158 個樣品及其不同組織部位中砷形態(tài)分布特征。測定色譜圖及數(shù)據(jù)結(jié)果分別見圖6和表8所示，4 種海蟹樣品測定色譜圖類似，均以AsB含量最高，其次是DMA和MMA，As（III）和As（V）僅在少量樣品有檢出；整蟹（除腮、殼后）及其不同部位樣品中AsB占總砷含量的60.9%～99.4%，4 種海蟹AsB平均含量值依次為細點圓趾蟹＜青蟹＜三疣梭子蟹＜日本鱘，同一品種的海蟹中AsB平均含量值性腺（雌）＞肝胰腺＞蟹胸肌肉＞蟹鉗肉＞蟹鰓，呈現(xiàn)的趨勢與總砷含量一致。結(jié)果表明海蟹雖作為砷高富集品種，但主要以有機砷AsB為主，無機砷含量較低，158 個海蟹樣品整蟹及分組織測定無機砷含量均值在0～0.12 mg/kg范圍內(nèi)，均未超過國家食品安全標(biāo)準對水產(chǎn)動物的無機砷限值（0.5 mg/kg）要求。AsB其結(jié)構(gòu)類似甜菜堿，LD50大于10 000 mg/kg，被視為無毒的有機砷形態(tài)[5,30]，在人體內(nèi)不能進行代謝，直接被排出體外，通常認為不會危及人體健康[6,31]，因此海蟹雖然作為砷元素高富集生物，但無機砷含量較低，食用海蟹帶來的無機砷健康風(fēng)險較低。

3 結(jié) 論

采用優(yōu)化后的ICP-MS法和HPLC-ICP-MS法分別測定了青蟹、三疣梭子蟹、日本鱘和細點圓趾蟹4 種常見海蟹中總砷及砷形態(tài)物分布特征。結(jié)果顯示海蟹是砷高富集水產(chǎn)品，158 個蟹類樣品中總砷含量范圍為0.37～35.81 mg/kg；整蟹及分組織進行砷形態(tài)物測定數(shù)據(jù)表明海蟹體內(nèi)以毒性較低的AsB為主，AsB占其總砷含量的60.9%～99.4%，158 個海蟹樣品無機砷含量均值在0～0.12 mg/kg；從分品種及同一品種下分組織部位的測定結(jié)果來看，總砷含量和AsB的測定均值基本都呈現(xiàn)出品種上細點圓趾蟹＜青蟹＜三疣梭子蟹＜日本鱘、同一品種樣品下性腺（雌）＞肝胰腺＞蟹胸肌肉＞蟹鉗肉＞蟹鰓的變化趨勢，說明日本鱘富集砷能力較強，性腺和肝胰腺是海蟹富集砷的重要器官。由于無機砷含量較低，均在國家標(biāo)準對水產(chǎn)品中無機砷的規(guī)定限量值以下，因此食用海蟹帶來的砷健康危害風(fēng)險較低。