楊艷艷，喬松林，李 睿，郭軍慶，李青梅，滕 蔓，王 麗，趙 東，李學伍，鄧瑞廣，張改平，2

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的一種豬的重要傳染病[1-2]，臨床特征表現(xiàn)為母豬的繁殖障礙、死胎、流產(chǎn)，以及各年齡段豬嚴重呼吸道癥狀[3-4]。該病于1987年首次在北美被發(fā)現(xiàn)[5]，我國于1996年首次從疑似PRRSV感染的豬群中分離出PRRSV[6]。20多年來，國內(nèi)外學者對PRRSV的分子流行病學、病毒復制機制、致病和免疫應答機制進行了大量的研究，也開發(fā)出了一系列的防控疫苗，但由于PRRSV獨特而復雜的免疫和致病機制，已開發(fā)的疫苗仍存在低效、不安全等諸多問題，距完全控制該病還相距甚遠[7]。目前，PRRS在世界范圍內(nèi)仍呈蔓延之勢，每次暴發(fā)都會給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失[8]。病毒特異性單克隆抗體是研究病毒免疫機制，特別是體液免疫識別機制的基本工具，也是開發(fā)和診斷檢測試劑的必需材料。制備病毒的單克隆抗體需要經(jīng)過抗原純化、小鼠免疫、細胞融合、單抗篩選、鑒定等重要步驟。其中，單抗篩選是指用病毒抗原來識別鑒定混合在大量雜交瘤細胞中少數(shù)能夠分泌特異性單克隆抗體雜交瘤細胞株的過程。建立準確、簡單、快速的高通量病毒單克隆抗體篩選方法，在細胞融合后用于短時間內(nèi)數(shù)百至數(shù)千個培養(yǎng)上清樣品的篩選，是制備病毒單克隆抗體的關鍵技術。PRRSV具有高變異性[9-10]，分為基因1型和2型，其特異性單克隆抗體的制備可以用于區(qū)分2個基因型的毒株[11]。此外，PRRSV是一種具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于套式病毒目(Nidovirales)動脈炎病毒科(Arteriviridae)動脈炎病毒屬(Arterivirus)。PRRSV的基因組中含有10個開放閱讀框，分別編碼14個非結構蛋白和8個結構蛋白，其中GP5、M和N蛋白是主要結構蛋白[12-13]，M蛋白和N蛋白較保守，N蛋白在病毒粒子中含量最高[14]。國內(nèi)外學者分別采用不同方法制備了針對PRRSV病毒結構蛋白和非結構蛋白的單抗[15-16]。國內(nèi)研究者對PRRSV病毒單克隆抗體的篩選多采用經(jīng)典的酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，但由于聚苯乙烯96孔板只能夠強力吸附可溶性蛋白而對顆粒病毒的吸附能力較差[17-18]，所以使用包被病毒進行單克隆抗體篩選時，常常出現(xiàn)目的抗體漏篩、非特異性抗體誤判或篩選完全失敗的結果。免疫過氧化物酶單層細胞試驗(Immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)常用于細胞蛋白質變化分析及畜禽體液免疫應答抗體的檢測[19-22]，也較多用于單克隆抗體篩選后的鑒定[23-25]，而使用IPMA法進行抗病毒單克隆抗體的初次篩選已有報道[26-27]，但缺乏技術細節(jié)。本研究對IPMA反應板的PRRSV感染量、感染時間、PRRSV感染細胞固定于96孔細胞培養(yǎng)板的條件等試驗細節(jié)進行優(yōu)化，以建立特異性強、敏感性高且適合高通量篩選病毒單抗的方法，并篩選出高特異性、高敏感性的抗PRRSV的單克隆抗體，建立詳細完整的IPMA篩選病毒單克隆抗體的方法，為其他動物疫病病毒單克隆抗體制備和篩選提供借鑒。

1 材料和方法

本研究于2016-2018年在河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室完成。

1.1 病毒和細胞

PRRSV高致病毒株HN07-1、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病毒(PRV)和傳代細胞Marc-145、PK-15、Vero細胞均由河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室保存，PRRSV經(jīng)典毒株BJ-4由中國農(nóng)業(yè)大學楊漢春教授惠贈，豬流行性腹瀉病毒(PEDV)由河南農(nóng)業(yè)大學王川慶教授惠贈，豬肺泡巨噬細胞系CRL-2843-CD163細胞株由西北農(nóng)林科技大學周恩民教授惠贈。

1.2 試驗試劑

胎牛血清、液體培養(yǎng)基1640、DMEM購自GIBCO；豬抗PRRSV陽性血清由河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室自制；山羊抗豬IgG-HRP和山羊抗鼠IgG-HRP購自Abbkine。

1.3 試驗儀器

生物安全柜、CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo fisher)；倒置光學顯微鏡(德國Leica)；實驗超凈工作臺；37 ℃普通溫箱；酶標儀及洗板機(TECAN)；96孔細胞板；移液加樣器。

1.4 Marc-145細胞培養(yǎng)和PRRSV感染增殖

將PRRSV病毒HN07-1接種Marc-145細胞，設未接毒細胞為對照，于37 ℃ 5% CO2條件下進行培養(yǎng)，分別在12，24，36，48，60，72 h時連續(xù)觀察細胞的狀態(tài)，并無菌收集病毒培養(yǎng)上清，于-70 ℃保存。

1.5 PRRSV的IPMA效價測定

制備5×104個/mL的Marc-145細胞懸液，以每孔100 μL加入96孔細胞培養(yǎng)板，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，待細胞的覆蓋度達到85%時，將1.4中6個時間點收集的待測病毒以10倍倍比梯度稀釋至10-6，每個稀釋度做2孔重復(結果取平均值)，12 h后棄除培養(yǎng)上清；每孔用100 μL甲醇(含3% H2O2)于37 ℃固定細胞10 min，棄除固定液；每孔用200 μL含5%脫脂乳的磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)于常溫下封閉1 h，棄除封閉液；每孔加入1∶200稀釋抗PRRSV的豬陽性血清100 μL，于37 ℃孵育30 min；用PBST洗板3次，每孔加入1∶500稀釋的羊抗豬IgG-HRP 100 μL，于37 ℃孵育30 min，PBST洗板3次；最后加入AEC底物顯色5 min，用蒸餾水終止顯色，在倒置光學顯微鏡下觀察感染PRRSV病毒的Marc-145細胞的染色情況。觀察順序為從較多染色孔開始觀察到最少染色孔，即從高濃度病毒感染孔到低濃病毒感染度孔，并將最后2個孔細胞染色數(shù)量≤10的病毒平均稀釋度倒數(shù)作為各時間點PRRSV病毒上清的IPMA效價。

1.6 IPMA反應板的制備

根據(jù)1.5的結果，選用每孔能夠感染約100個細胞的PRRSV病毒稀釋度(用于IPMA的PRRSV病毒效價的前一個稀釋度)接種96孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的單層Marc-145細胞來制備IPMA反應板，其中保留2個孔(G12和H12)不接種病毒，將其設為對照，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育12 h后棄除培養(yǎng)上清，然后用甲醇固定細胞10 min后棄除固定液，每孔再用200 μL含5%脫脂乳的PBST于常溫下封閉1 h，備用。

1.7 IPMA法篩選PRRSV單克隆抗體

融合后的雜交瘤細胞培養(yǎng)10 d后開始篩選。將96孔細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)上清以每孔100 μL轉移至制備好的IPMA反應板中，并設置陽性試驗孔和陰性對照孔，在孔E12和G12中加入1∶600稀釋的PRRSV免疫鼠陽性血清(或1∶200稀釋的豬PRRSV陽性血清)，在孔F12和H12中加入1∶600稀釋的PRRSV陰性鼠血清，于37 ℃孵育30 min后用PBST洗板3次，再于每孔加入1∶500稀釋的羊抗鼠IgG-HRP(或1∶500稀釋的羊抗豬IgG-HRP)100 μL，于37 ℃孵育30 min后用PBST洗板3次，最后加入AEC底物顯色5 min，蒸餾水終止顯色，最后顯微鏡下分析染色。顯微鏡下首先觀察設置的試驗對照孔，然后掃描分析每個檢測孔，根據(jù)感染細胞的特異性染色判定單克隆抗體。

1.8 PRRSV單克隆抗體的穩(wěn)定性試驗

將PRRSV單克隆抗體陽性孔的培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基，取培養(yǎng)24，48，72 h時的培養(yǎng)基上清，重復篩選試驗。

1.9 PRRSV單克隆抗體的交叉反應試驗

將5×104個/mL的CRL-2843-CD163細胞、PK-15細胞和Vero細胞懸液分別鋪至96孔細胞培養(yǎng)板。PRRSV的HN07-1和BJ-4毒株分別接種于CRL-2843-CD163細胞，CSFV、PRV分別接種于PK-15細胞，PEDV接種于Vero細胞，每種病毒量為每孔能感染100個細胞左右，留未感染的正常細胞為對照。檢測抗體上清(一抗)，以各對應病毒株的豬陽性血清或特異性單克隆抗體為一抗陽性對照，二抗為山羊抗鼠IgG-HRP和山羊抗豬IgG-HRP，最后加入AEC底物顯色。

1.10 PRRSV的HN07-1毒株單克隆抗體免疫印跡試驗

將經(jīng)Sepharose 4 Fast Flow提純的PRRSV(HN07-1毒株)進行SDS-PAGE電泳后，進行蛋白質免疫印跡(Western Blotting)試驗。

1.11 單克隆抗體與PRRSV重組N蛋白ELISA試驗

用得到的10 μg/mL重組N蛋白(試驗)和pET28a質粒轉化細菌蛋白(對照)包被ELISA板，試驗孔和對照孔分別用豬PRRSV陽性血清和豬PRRSV陰性血清，二抗為山羊抗鼠IgG-HRP和山羊抗豬IgG-HRP，最后加入TMB進行底物顯色。

2 結果與分析

2.1 不同PRRSV感染時間Marc-145細胞的狀態(tài)和上清中的病毒增殖效價

PRRSV感染Marc-145細胞12 h時，Marc-145細胞狀態(tài)仍然處于最佳時期，PRRSV尚在胞漿中進行復制，IPMA效價檢測結果表明，此時PRRSV尚沒有釋放至培養(yǎng)基中，是進行IPMA試驗的最佳時間。但隨著感染時間延長，PRRSV快速分裂繁殖，出現(xiàn)細胞融合病變(CPE)使Marc-145細胞死亡脫落離壁(表1)。

表1 不同PRRSV感染時間對Marc-145細胞狀態(tài)的影響Tab.1 The effect of PRRSV infection time on Marc-145 cell culture

不同時間段收集的PRRSV感染Marc-145細胞的培養(yǎng)上清做10倍遞增稀釋接種細胞發(fā)現(xiàn)，細胞染色孔數(shù)量與IPMA效價成正相關。將PRRSV感染12 h時收集的Marc-145細胞的培養(yǎng)上清進行10倍稀釋接種細胞后發(fā)現(xiàn)，沒有細胞染色，無IPMA效價。當PRRSV感染24，36，48 h時，Marc-145細胞培養(yǎng)上清中病毒效價較高。當PRRSV感染60 h和72 h時，隨著Marc-145細胞受損嚴重(CPE++++)，病毒效價開始明顯下降(圖1)。因此，篩選PRRSV單克隆抗體制備IPMA板時應選用PRRSV感染24～48 h的Marc-145細胞培養(yǎng)上清，病毒接種量為效價的前一個稀釋度。

圖1 不同PRRSV感染時間上清中病毒的IPMA效價(lg)Fig.1 The IPMA titers of PRRSV culture supernatant in different infected time

2.2 IPMA的篩選時間、反應條件和PRRSV單克隆抗體染色的鑒別判定及處理依據(jù)

以96孔細胞培養(yǎng)板中雜交瘤細胞融合后的10 d時檢測培養(yǎng)上清最佳，此時高敏感性單克隆抗體(僅占孔底面積1/20)即可被檢出。從顯微鏡中觀察IPMA染色，判定篩選的單克隆抗體結果：首先觀察所設的試驗對照孔(PRRSV抗體陽性及陰性血清孔)染色，試驗的陽性孔的細胞胞漿被染色，多抗常伴有非特異著染(圖2-A-B)，試驗的陰性孔的細胞未被染色(圖2-C)，陽性和陰性血清顯色結果正確說明試驗可靠。然后觀察檢測孔的染色，檢測孔中有100個左右的細胞胞漿清晰染色(無任何其他背景著染)，判定為細胞上清分泌PRRSV特異性單克隆抗體(圖2-D)，要格外注意篩到的分泌特異性單抗的細胞，注意培養(yǎng)和凍存，避免污染而檢測孔中無細胞染色或細胞普遍染色的是無抗體分泌和非特異性抗體反應(圖2-D-F)，可棄之。

A.PRRSV免疫小鼠的陽性血清；B.豬PRRSV陽性血清；C.PRRSV陰性鼠血清；D.PRRSV特異性單克隆抗體；E-F.非特異性Abs。A.Serum of PRRSV immunized mice; B.Porcine PRRSV positive serum; C.PRRSV negative mouse serum; D.PRRSV specific mAb; E-F.Nonspecific Abs.

2.3 PRRSV單克隆抗體穩(wěn)定性和特異性

將PRRSV單克隆抗體孔的培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72 h后，再收集細胞培養(yǎng)上清進行重復試驗發(fā)現(xiàn)反應穩(wěn)定。將篩選到的含有PRRSV單克隆抗體(39份)的上清分別與CSFV、PRV、PEDV感染細胞進行IMPA檢測發(fā)現(xiàn)，所有單克隆抗體僅和PRRSV感染的CRL-2843-CD163細胞產(chǎn)生染色反應，與其他病毒株的感染無交叉反應(表2)，表明篩選的PRRSV單克隆抗體特異性良好。

2.4 PRRSV單克隆抗體的Western Blotting結果

通過Western Blotting對篩選的PRRSV單克隆抗體進行鑒定發(fā)現(xiàn)，39份PRRSV單克隆抗體中有26份能與PRRSV的HN07-1毒株的N蛋白條帶產(chǎn)生良好顯色，如單抗1D1(圖3)。

表2 IPMA交叉反應試驗結果Tab.2 The cross reactivity of the IPAM assay

注：+.感染細胞染色；-.無細胞染色。

Note：+.Staining；-.No staining.

圖3 PRRSV單克隆抗體1D1的Western BlottingFig.3 Western Blotting result with PRRSV mAb 1D1

2.5 PRRSV單克隆抗體與重組N蛋白的ELISA結果

利用大腸桿菌表達系統(tǒng)所制備的重組N蛋白包被ELISA板后對PRRSV單克隆抗體進行分析發(fā)現(xiàn)，1D1、7G8等27份單克隆抗體能與重組N蛋白產(chǎn)生良好反應，OD值在0.981～1.329(表3)；6E7、7F12等15份單克隆抗體不能與重組N蛋白發(fā)生反應，OD值在0.043～0.050(表3)。

表3 PRRSV單克隆抗體與重組N蛋白包被的ELISA結果(OD450)Tab.3 The reactivity of the mAbs with PRRSV N protein by ELISA(OD450)

3 結論與討論

細胞成功融合后，雜交瘤細胞樣品數(shù)量巨大(108個B細胞和5×107個骨髓瘤細胞融合后分散在10～40塊96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，共有960～3 840個樣品)，因此建立快速準確的高通量篩選方法是制備PRRSV單克隆抗體的關鍵。此前，國內(nèi)外學者曾經(jīng)采用ELISA方法篩選鑒定單抗[28-29]。前期研究中也曾多次使用同樣的方法進行病毒包被建立ELISA方法并用于PRRSV單克隆抗體的篩選，盡管病毒純化、小鼠免疫和細胞融合過程均取得成功，但難以篩選出敏感性高、特異性強的PRRSV單克隆抗體。分析原因可能是由于聚苯乙烯96孔板不能牢固吸附完整的顆粒病毒，在反應過程中多次洗滌會造成病毒顆粒脫落，從而導致PRRSV單克隆抗體篩選的失敗。用IPMA方法篩選PRRSV單克隆抗體時，PRRSV病毒可通過感染細胞進行增殖并被固定在96孔細胞培養(yǎng)板上從而直接捕獲PRRSV單克隆抗體，所獲得的PRRSV單克隆抗體具有高度特異性。Yoon等[30]和Liang等[31]的報道中，對病毒的單克隆抗體進行篩選的試驗中IPMA比ELISA的免疫反應更敏感、準確，這與本研究的結果一致。

應用IPMA法篩選抗病毒的單克隆抗體時特別要注意做好以下幾點：①細胞單層，接種病毒時用覆蓋度為80%～85%對數(shù)生長期的單層細胞，以利于病毒的快速分裂和繁殖，感染的單層細胞在培養(yǎng)12～15 h時狀態(tài)最好，此時固定并進行后續(xù)試驗，染色后的結果最佳；②定量接種病毒，以每孔能夠感染100個細胞的PRRSV病毒量最佳，若接種的病毒過多，細胞感染率過高或全部感染均不易區(qū)分，而病毒接種太少則容易漏篩；③細胞固定時間，當病毒感染細胞后，一定時間內(nèi)病毒于胞漿進行復制，選擇病毒未大量釋放胞外前的時間進行細胞固定，例如對于PRRSV的HN07-1毒株來說，于感染細胞12～15 h時對細胞進行固定最佳；④選擇適當?shù)募毎潭▌?，合適的細胞固定劑能夠讓細胞更具通透性，有利于抗體與病毒的接觸；⑤單克隆抗體開始篩選的時間，當雜交瘤細胞融合后繼續(xù)生長10 d左右，此時雜交瘤細胞的覆蓋度達到16.7%以上，開始進行篩檢最佳；⑥篩選對照的設置，試驗中應設置抗體的陽性對照和陰性對照，對已篩出的單克隆抗體進行重復IPMA篩選時還應設置正常細胞對照。

本研究將定量感染復制在Marc-145細胞內(nèi)的PRRSV固定在含有單層細胞的96孔IPMA板上，從而精準篩選出融合后的雜交瘤細胞所分泌的抗PRRSV單克隆抗體，39份含有PRRSV單克隆抗體的上清經(jīng)過交叉反應試驗、Western Blotting和重組N蛋白的ELISA試驗后，證實所篩選到的PRRSV單克隆抗體具備高度特異性和敏感性。本研究所得的IPMA法既適用于PRRSV單克隆抗體制備中的樣品初篩和鑒定，也適用于對PRRSV單克隆抗體的特異性鑒定。