李靜嫻，陳萬生

(海軍軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200003)

復(fù)方薄荷酚酸酊(曾用名 皮炎酊)是海軍軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院的非標(biāo)準(zhǔn)制劑[批準(zhǔn)文號：總制字(2017)F506036]，為本院皮膚科外用特色制劑之一，由苯酚、地塞米松磷酸鈉、硼酸、薄荷腦、乙醇組成，臨床上主要用于治療夏季接觸性皮炎、皮膚瘙癢癥，療效顯著。由于該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定年代較早，原標(biāo)準(zhǔn)僅通過測定苯酚和地塞米松磷酸鈉的含量來控制制劑的質(zhì)量，對其他主要成分缺乏相應(yīng)的質(zhì)量控制，不能全面反映制劑質(zhì)量。作者查閱資料，發(fā)現(xiàn)2015年版《中華人民共和國藥典》(簡稱藥典)二部中地塞米松磷酸鈉的含量測定以地塞米松磷酸酯為定量指標(biāo)[1]，有別于原標(biāo)準(zhǔn)中用地塞米松磷酸鈉對照品直接測定含量。為了更好地控制復(fù)方薄荷酚酸酊的質(zhì)量，保證臨床用藥安全，本研究以薄荷腦為定性指標(biāo)建立了薄層色譜法(TLC)；以硼酸為定量指標(biāo)建立了酸堿滴定法；以苯酚、地塞米松磷酸鈉為定量指標(biāo)，用地塞米松磷酸酯代替地塞米松磷酸鈉作為對照品，重新建立HPLC定量法；并測定了乙醇的含量，制定了合理限度標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司，包括G1311C輸液泵、G1329B自動進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G4212B-DAD二極管陣列檢測器和Chemstation色譜工作站)；XA205DU型電子天平(瑞士梅特勒-特利多儀器公司，精度0.01 mg)；WL-901 Vortex旋渦振蕩混和器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；SK7200H型超聲儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；硅膠G薄層板(預(yù)制板，青島海洋化工集團(tuán)公司)。

1.2 試藥 復(fù)方薄荷酚酸酊(海軍軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院藥學(xué)部自制，批號150424、150520、150528、150604、150611、150616、150710、150721、150722、150813，規(guī)格60 ml/瓶)；地塞米松磷酸酯對照品(含量98.6%，批號101116-201102)、苯酚對照品(批號100509-201203)、薄荷腦對照品(批號110728-200506)購自中國食品藥品檢定研究院；硼酸(批號20140305)、甘露醇(批號20120220)、甲苯、乙酸乙酯、甲醇、無水乙酸鈉、冰乙酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲醇(色譜純，德國默克公司)；香草醛(純度>98%，廣東光華科技股份有限公司)；氫氧化鈉滴定液(0.1 mol/L，自行配制標(biāo)定，F(xiàn)值1.002 2)；注射用水(自制)。

2 方法和結(jié)果

2.1 薄荷腦定性鑒別[1]取復(fù)方薄荷酚酸酊(批號150721、150722、150813)適量作為供試品溶液。取薄荷腦對照品加甲醇制成濃度為10 mg/ml的對照品溶液。按照制劑處方制備不含薄荷腦的復(fù)方薄荷酚酸酊陰性樣品，取陰性樣品適量作為陰性對照。按2015年版藥典四部TLC實驗操作方法[1]，吸取上述3種溶液各2 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯(V∶V=19∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛濃硫酸-乙醇(1∶4)的混合溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。在供試品色譜中，與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照色譜無相應(yīng)斑點，見圖1。

圖1 薄荷腦的TLC譜圖Figure 1 TLC chromatograms of menthol1～3：供試品溶液(批號分別為150721、150722、150813)；4：薄荷腦對照品溶液；5：缺薄荷腦的陰性對照溶液

2.2 乙醇含量測定 取1.2項下10個批次的復(fù)方薄荷酚酸酊，各精密量取25 ml，置150～200 ml蒸餾瓶中，加水約50 ml。按照2015年版藥典四部通則0711乙醇量測定法第二法蒸餾法[1]，測定樣品中乙醇的含量，每批次平行測定2份。結(jié)果顯示，樣品中乙醇的含量為44%～50%，平均值為47%，擬定復(fù)方薄荷酚酸酊中乙醇的量在42%～52%。

2.3 酸堿滴定法測定硼酸的含量[1]

2.3.1 供試品溶液的制備 精密量取復(fù)方薄荷酚酸酊(批號150721、150722、150813)5 ml，置錐形瓶中，加入甘露醇4 g及新沸過的冷水10 ml，搖勻，即得。

2.3.2 樣品含量測定 供試品溶液中加入酚酞指示液4滴，用標(biāo)定好的氫氧化鈉滴定液(0.1 mol/L)滴定至溶液顯粉紅色。每1 ml氫氧化鈉滴定液(0.1 mol/L)相當(dāng)于6.184 mg的硼酸(H3BO3)。結(jié)果見表1。

表 1 復(fù)方薄荷酚酸酊中苯酚、地塞米松磷酸鈉和硼酸的含量測定結(jié)果Table 1 Content determination results of phenol,dexamethasone sodium phosphate and boric acid in Fufangbohefensuan tincture 標(biāo)示量%)

2.4 苯酚、地塞米松磷酸鈉的含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.05 mol/L乙酸鈉溶液(用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至4.0)-甲醇(40∶60)；檢測波長：242 nm；進(jìn)樣量20 μl；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃。

2.4.2 溶液配制 (1)苯酚對照品儲備液：精密稱取苯酚對照品1.004 0 g，置50 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為20.08 mg/ml的苯酚對照品儲備液。(2)地塞米松磷酸酯對照品儲備液： 精密稱取地塞米松磷酸酯對照品10.4 mg，置25 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.41 mg/ml的地塞米松磷酸酯對照品儲備液。(3)混合對照品溶液：分別精密量取苯酚對照品儲備液、地塞米松磷酸酯對照品儲備液各2.5 ml，置同一50 ml量瓶中，用流動相稀釋并定容至刻度，搖勻，得苯酚、地塞米松磷酸酯濃度分別為1004、20.5 μg/ml的混合對照品溶液。(4)供試品溶液：精密量取復(fù)方薄荷酚酸酊(批號150721、150722、150813)5 ml，置50 ml量瓶中，加流動相稀釋并定容至刻度，搖勻，做為供試品溶液。(5)陰性對照溶液：按復(fù)方薄荷酚酸酊處方分別配制缺苯酚和地塞米松磷酸鈉的陰性樣品，再按(4)項下方法制成陰性對照溶液。

2.4.3 專屬性實驗 分別取苯酚、地塞米松磷酸酯混合對照品溶液、供試品溶液、苯酚陰性對照溶液和地塞米松磷酸鈉陰性對照溶液，按 2.4.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，供試品與對照品溶液中待測物保留時間一致，陰性對照溶液在相應(yīng)位置無吸收峰，表明制劑中其他成分對苯酚和地塞米松磷酸鈉的測定無干擾。

圖2 復(fù)方薄荷酚酸酊的HPLC譜圖Figure 2 HPLC chromatograms of Fufangbohefensuan tinctureA:混合對照品溶液；B：供試品溶液；C:缺苯酚的陰性對照溶液；D：缺地塞米松磷酸鈉的陰性對照溶液；1：苯酚；2：地塞米松磷酸酯;3：地塞米松磷酸鈉

2.4.4 線性關(guān)系考察 (1)精密量取2.4.2(1)項下苯酚對照品儲備液2.5、4、5、6、7.5 ml，置100 ml量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻，制成濃度為502、803、1004、1205、1506 μg/ml的系列對照品溶液；(2)取2.4.2(2)項下地塞米松磷酸酯對照品儲備液適量，采用逐級稀釋的方法，加流動相制成地塞米松磷酸酯濃度分別為82.0、41.0、20.5、10.25、5.13 μg/ml的對照品溶液，按2.4.1項下色譜條件進(jìn)行測定，分別以苯酚和地塞米松磷酸酯濃度(c)和峰面積(A)進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程分別為A1=1.015 2c1-8.977 6(r=0.999 9)、A2=33.095c2-26.232(r=0.999 9)。結(jié)果表明，苯酚和地塞米松磷酸酯分別在502～1506 μg/ml和5.13～82.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,計算得地塞米松磷酸鈉在5.61～89.63 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度實驗 精密吸取 2.4.2(3)項下混合對照品溶液適量，按2.4.1項下色譜條件平行進(jìn)樣6次。結(jié)果顯示，苯酚、地塞米松磷酸酯峰面積的RSD分別為0.11%和0.36%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4.6 重復(fù)性實驗 精密量取復(fù)方薄荷酚酸酊(批號150721)適量，按2.4.2(4)項下方法平行制備6份供試品溶液，再按2.4.1項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，苯酚和地塞米松磷酸鈉峰面積的RSD分別為0.20%和0.30%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.7 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液分別于0、2、4、6、8、12、16、24、36、48 h按2.4.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果苯酚、地塞米松磷酸鈉的色譜峰面積RSD分別為0.35%和0.37%(n=10),結(jié)果表明供試品溶液在室溫下放置48 h穩(wěn)定。

2.4.8 加樣回收率實驗 分別精密量取已知含量的復(fù)方薄荷酚酸酊(批號150721)5 ml，置9個100 ml量瓶中，分為3組，每組3份，每組分別精密加入苯酚、地塞米松磷酸酯對照品儲備液各2、2.5、3 ml，用流動相定容至刻度，搖勻。按2.4.1項下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，苯酚按外標(biāo)法以峰面積計算含量，地塞米松磷酸鈉按外標(biāo)法以峰面積乘以1.093 1計算含量[1]，結(jié)果苯酚和地塞米松磷酸鈉的平均加樣回收率分別為(99.4±0.36)%、(100.1±0.29)%(n=3)。

2.4.9 含量測定 取批號分別為150721、150722、150813的復(fù)方薄荷酚酸酊樣品，按照2.4.2(4)項下方法制備并按2.4.1項下色譜條件進(jìn)樣后記錄峰面積，分別按外標(biāo)法以峰面積計算苯酚的含量，按外標(biāo)法以峰面積乘以1.093 1計算地塞米松磷酸鈉的含量，結(jié)果見表1。

3 討 論

3.1 乙醇含量限度標(biāo)準(zhǔn)的確定 酊劑系指將原料藥物用規(guī)定濃度的乙醇提取或溶解而制成的澄清液體制劑[1]，2015年版藥典四部通則對酊劑的有關(guān)規(guī)定中新增了乙醇量的檢查要求。乙醇量測定法分為氣相色譜法和蒸餾法，本制劑中乙醇含量>30%，考慮到日常檢測的便捷，使用了第二法蒸餾法進(jìn)行乙醇量的測定。經(jīng)過10個批次的測定并計算，最終確定42%～52%為復(fù)方薄荷酚酸酊中乙醇量的合格范圍，為日常檢測提供了依據(jù)。

3.2 苯酚和地塞米松磷酸鈉的含量測定 2015年版藥典出版以前，多數(shù)文獻(xiàn)[2-5]報道地塞米松磷酸鈉的含量測定以地塞米松磷酸鈉為指標(biāo)物，同樣包括本制劑原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究參照2015年版藥典二部中地塞米松磷酸鈉的含量測定方法[1]，以地塞米松磷酸酯作為指標(biāo)物對地塞米松磷酸鈉進(jìn)行定量研究，波長為242 nm。根據(jù)制劑處方，復(fù)方薄荷酚酸酊中苯酚的濃度高達(dá)10 mg/ml，為地塞米松磷酸鈉濃度的50倍，原標(biāo)準(zhǔn)中采用樣品直接過濾進(jìn)樣，供試品中苯酚濃度過高，系統(tǒng)殘留嚴(yán)重，且不利于色譜柱的維護(hù)和保養(yǎng)。因此，作者參照文獻(xiàn)[6-8]中苯酚的線性范圍，將復(fù)方薄荷酚酸酊稀釋至原濃度的1/2、1/5、1/10、1/20，作為供試品進(jìn)行研究，并在不同濃度下同時監(jiān)測地塞米松磷酸鈉的響應(yīng)強度，發(fā)現(xiàn)將復(fù)方薄荷酚酸酊稀釋為原濃度的1/10，即苯酚濃度為1 mg/ml時最優(yōu)。流動相的選擇則根據(jù)文獻(xiàn)[2]進(jìn)行比例上的優(yōu)化，使苯酚和地塞米松磷酸鈉的峰形及分離度更好。

綜上所述，本研究建立的方法簡便，并增加了乙醇含量檢查，使復(fù)方薄荷酚酸酊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更加完善，為該制劑的質(zhì)量控制提供了更準(zhǔn)確、可靠的依據(jù)。