趙亞軍，裴彩霞，劉強，鈔瑞敏，陳婧

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

近年來，活性酵母作為動物飼料添加劑應(yīng)用廣泛。據(jù)報道，反芻動物飼糧中添加活性酵母菌制劑對反芻動物瘤胃發(fā)酵、生產(chǎn)性能、產(chǎn)品質(zhì)量以及機體免疫水平等方面產(chǎn)生積極的作用[1～4]，在反芻動物添加劑領(lǐng)域具有非常大的潛力和發(fā)展空間。目前，關(guān)于酵母菌的研究很多，但研究結(jié)果存在一定差異。Dawson等[5]試驗發(fā)現(xiàn)奶牛日糧中添加酵母菌制劑可以增加瘤胃活菌的數(shù)量；Erasmus等[6]發(fā)現(xiàn)酵母添加劑使奶牛MCP合成有增加趨勢；張棋煒等[7]研究發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)合酵母發(fā)酵飼料能夠增加發(fā)酵液的產(chǎn)氣量，提高NH3-N含量，促進乙酸、丁酸和TVFA的生成；李常瑞等[8]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合酵母可以提高底物的干物質(zhì)降解率和氨氮、VFA濃度，對瘤胃發(fā)酵具有一定的促進作用。這些差異可能是由于菌株的不同引起的，而不同酵母菌間的復(fù)合效應(yīng)尚未見報道。

本試驗擬研究高精料條件下，通過研究5株單一酵母及其不同組合對牛瘤胃發(fā)酵液參數(shù)的影響，以探討不同酵母菌間的復(fù)合效應(yīng)，為反芻動物生產(chǎn)中優(yōu)質(zhì)、高效復(fù)合酵母菌株的篩選及其營養(yǎng)生理調(diào)控研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis,I)、釀酒酵母A(SaccharomycescerevisiaeA,Ⅱ)、釀酒酵母B(SaccharomycescerevisiaeB,Ⅲ)、釀酒酵母C(SaccharomycescerevisiaeC,IV)和熱帶假絲酵母(Candidatropicalis,V)等5株酵母菌均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)實驗室提供。

1.2 試驗動物及飼養(yǎng)管理

試驗選取2頭體況良好安裝有永久性瘤胃瘺管(內(nèi)徑約8 cm)的晉南牛作為瘤胃液供體。試驗動物單欄飼養(yǎng)，試驗前分別進行免疫和驅(qū)蟲處理。飼糧按精粗比65:35配制(精料組成為玉米66.8%，豆粕30%，石粉1.6%，食鹽0.6%，預(yù)混料1%；粗料為青貯玉米秸稈)分別于每日08:00與20:00各飼喂一次，自由飲水。

1.3 試驗方法

1.3.1 人工瘤胃緩沖液配制

人工瘤胃緩沖液在厭氧條件下配制，其各組分參照Menke等[9]的方法配制，組成見表1。單株酵母添加劑活菌數(shù)為1×108CFU·30 mL-1，2株酵母及3株酵母組合添加劑分別按體積(V/V)1∶1、1∶1∶1配制，使各組合的活菌數(shù)達到1×108CFU·30 mL-1。

1.3.2 瘤胃液的采集

晨飼前2 h通過瘤胃瘺管采集2頭牛瘤胃液并按1∶1(V/V)的比例混合，混合好的培養(yǎng)液投入充滿CO2的保溫箱(39 ℃)，預(yù)熱迅速帶回實驗室。

表1 人工瘤胃緩沖液各組分組成Table 1 Composition of artificial rumen buffer

1.3.3 體外培養(yǎng)

試驗所用飼料與供體動物飼喂的飼料一致，飼料原料于65 ℃下烘干后粉碎并過2 mm目篩，每個發(fā)酵管及發(fā)酵瓶分裝300 mg培養(yǎng)底物。試驗設(shè)對照組(培養(yǎng)液)、單一酵母菌處理(單一酵母培養(yǎng)液)和復(fù)合酵母處理(復(fù)合酵母培養(yǎng)液)等多個處理，每個處理均設(shè)3個重復(fù)。將采集的瘤胃液測定pH值后經(jīng)4層紗布過濾，將瘤胃液與人工瘤胃緩沖液以1∶2(V/V)混合，制成人工瘤胃培養(yǎng)液。吸取培養(yǎng)液30 mL，注入已裝有樣品的發(fā)酵管及發(fā)酵瓶中，添加活性酵母，使活菌數(shù)達到1×108CFU·30 mL-1培養(yǎng)液，整個過程避免與空氣的直接接觸，在39 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)發(fā)酵48 h。

1.3.4 樣品的采集和測定

分別于發(fā)酵培養(yǎng)后3、6、9、12、18、24、36、48 h通過讀發(fā)酵管刻度記錄產(chǎn)氣量，并收集氣體，同時采用pH計(EC-pH510標(biāo)準(zhǔn)智能型臺式)測定發(fā)酵瓶收集的培養(yǎng)液pH值，并計算其平均值。發(fā)酵48 h后，測定pH值并分裝。置于-40 ℃冷凍保存。其中，用于測定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的5 mL樣品中加入1 mL的25%偏磷酸巴豆酸；用于測定氨態(tài)氮濃度(NH3-N)的5 mL樣品中加入1 mL 20 g·L-1的硫酸。VFA、甲烷濃度采用TRACE-1300氣相色譜儀(Thermo Fisher Scientific，美國)進行測定，微生物蛋白(MCP)[10]、NH3-N濃度[11]采用比色法測定，總產(chǎn)氣量為各不同時間點產(chǎn)氣量之和[9]。

所有體外發(fā)酵試驗均設(shè)2次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件中的One-way-Anova進行方差分析，用P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 5株酵母菌及其組合對體外發(fā)酵pH、飼料降解率、NH3-N濃度、MCP、產(chǎn)氣量和甲烷的影響

由表2可知，添加不同組合酵母菌對培養(yǎng)液pH值產(chǎn)生了不同影響。2株酵母組合中，I分別與Ⅱ、Ⅲ、IV、V組合后，Ⅲ分別與Ⅱ、IV、V組合后的pH值高于其中一株單菌，而與另一單菌無顯著差異；Ⅱ分別與IV、V組合后極顯著高于Ⅱ(P<0.01)，顯著高于IV、V(P<0.05)。3株酵母Ⅱ+Ⅲ+IV組合pH值顯著低于Ⅱ+Ⅲ(P<0.05)，Ⅱ+Ⅲ+V顯著低于Ⅲ+IV、Ⅲ+V(P<0.05)，Ⅱ+Ⅲ+IV、Ⅱ+IV+V極顯著低于Ⅱ+IV(P<0.01)。

降解率方面，2株復(fù)合酵母較單菌變化較小，僅IV+V顯著高于V(P<0.05)；3株復(fù)合菌中，Ⅱ+Ⅲ+IV顯著高于IV、Ⅲ+IV(P<0.05)，Ⅱ+IV+V顯著高于IV+V(P<0.05)。

NH3-N濃度方面，2株酵母組合中，I+IV、Ⅱ+IV、Ⅱ+V、Ⅲ+IV組合高于其中一株單菌，而與另一單菌無顯著差異；Ⅲ+IV、IV+V組合均顯著低于各單一菌株。3株菌中僅Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V組合NH3-N濃度顯著低于V(P<0.05)。MCP濃度方面，I、Ⅱ、Ⅲ、IV分別與V組合顯著高于V，而與另一單菌無顯著差異(P>0.05)；Ⅱ+Ⅲ+IV極顯著高于IV、Ⅱ+Ⅲ、Ⅲ+IV(P<0.01)；Ⅱ+IV+V極顯著高于IV、V(P<0.01)，顯著高于V、Ⅱ+V、IV+V(P<0.05)；Ⅱ+Ⅲ+V顯著高于V、Ⅱ+Ⅲ、Ⅱ+V(P<0.05)。

產(chǎn)氣方面，Ⅱ與I、Ⅲ組合低于其中一株單菌，而與另一單菌無顯著差異；Ⅱ分別與IV、V組合后極顯著低于Ⅱ(P<0.01)，顯著低于IV、V(P<0.05)；Ⅱ+Ⅲ+V顯著低于Ⅲ+V(P<0.05)。甲烷方面，I與Ⅱ、Ⅲ、IV、V組合后較各單菌均無顯著差異(P>0.05)；Ⅱ與Ⅲ、IV、V組合后甲烷含量低于其中一株單菌，而與另一單菌無顯著差異；3株菌Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V組合極顯著低于Ⅱ(P<0.01)。

2.2 5株酵母菌及其組合對體外發(fā)酵VFA的影響

由表3可知，在高精料下，培養(yǎng)液中2株酵母組合在乙酸、丙酸和異丁酸的比例以及乙丙比方面較各單一菌株均無顯著差異(P>0.05)，而3株酵母組合則產(chǎn)生了不同影響，其中，乙酸比例方面，Ⅱ+Ⅲ+IV顯著低于IV、Ⅱ+Ⅲ，Ⅱ+Ⅲ+V顯著低于Ⅱ、V、Ⅲ+V，Ⅱ+IV+V顯著低于Ⅱ、IV、Ⅱ+V(P<0.05)；Ⅱ+Ⅲ+V極顯著低于Ⅱ+Ⅲ、Ⅱ+V，Ⅱ+IV+V極顯著低于IV+V(P<0.01)。丙酸比例方面，Ⅱ+Ⅲ+IV顯著高于Ⅱ、IV、Ⅱ+Ⅲ、Ⅱ+IV(P<0.05)；Ⅱ+Ⅲ+V顯著高于Ⅱ+V、Ⅲ+V(P<0.05)；極顯著高于Ⅱ、Ⅲ、V、Ⅱ+Ⅲ(P<0.01)。同樣，Ⅱ+IV+V除顯著高于Ⅱ+V外，均極顯著高于組內(nèi)各單一及2株組合菌(P<0.01)。乙丙比方面，Ⅱ+Ⅲ+IV顯著低于Ⅱ、Ⅱ+IV(P<0.05)，極顯著低于IV、Ⅱ+Ⅲ(P<0.01)；Ⅱ+IV+V除顯著低于Ⅱ+V外，均極顯著低于組內(nèi)其他各單一及2株組合菌(P<0.01)；而Ⅱ+Ⅲ+V均極顯著低于組內(nèi)各單一及2株組合菌(P<0.01)。丁酸比例方面，Ⅱ+V、Ⅲ+V顯著低于Ⅱ、Ⅲ(P<0.05)，而與V無顯著差異。戊酸比例方面，I+IV、Ⅱ+IV、V+I、Ⅲ+IV、V+Ⅱ組合低于其中一株單菌，而與另一單菌無顯著差異。Ⅱ+Ⅲ+IV、Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V組合均極顯著高于組內(nèi)各單一及2株組合菌(P<0.01)。異戊酸比例方面，I+IV、I+V、Ⅲ+V組合低于其中一株單菌，而與另一單菌無顯著差異。Ⅲ+IV組合均極顯著低于Ⅲ、IV(P<0.01)。TVFA方面，I+IV、I+V、Ⅱ+IV、低于其中一株單菌，而與另一單菌無顯著差異。Ⅲ+IV、Ⅲ+V組合TVFA含量均顯著低于Ⅲ，分別顯著低于IV(P<0.05)，極顯著低于V(P<0.01)；3株菌Ⅱ+IV+V組合顯著低于IV、V(P<0.05)。

表2 酵母菌及其組合對體外發(fā)酵pH、飼料降解率、NH3-N濃度、MCP、產(chǎn)氣量和甲烷的影響Table 2 Effects of yeasts and their combinations on pH,degradation rate,NH3-N,MCP,gas production and methane production in vitro

注：2株酵母(α+β)：分別與“α、β”相比差異極顯著(P<0.01)標(biāo)記為“A、B”，差異顯著標(biāo)記為“a、b”(P<0.05)。3株酵母(ɑ+β+θ)：分別與“α、β、θ、α+β、α+θ、β+θ”相比差異極顯著(P<0.01)標(biāo)記為“A、B、C、D、E、F”，差異顯著標(biāo)記為“a、b、c、d、e、f”(P<0.05)。下表同。
Note:Two kinds of yeast (α+β):marked “A,B” with significantly different from “α,β”(P<0.01),and marked “a,b” with significant difference (P<0.05).Three kinds of yeast (ɑ+β+θ):marked “A,B,C,D,E,F” with extremely significantly different from “α,β,θ,α+β,α+θ,β+θ”(P<0.01),and marked “a,b,c,d,e,f” with significant difference (P<0.05).The same as below.

3 討論

瘤胃pH是評價瘤胃發(fā)酵環(huán)境的一項重要指標(biāo)。高精料飼糧模式下，反芻動物咀嚼行為減少，唾液分泌量降低使唾液對瘤胃的沖作用下降[12]，伴隨著VFA在瘤胃的沉積，導(dǎo)致瘤胃pH降低[13]。大量研究表明，酵母菌對穩(wěn)定瘤胃pH具有積極作用，能夠預(yù)防瘤胃酸中毒[14～16]。其作用機制可能是酵母菌促進了乳酸利用菌的增長從而緩解瘤胃pH的降低[17]，或酵母菌與作用在植物細胞壁上的微生物相互作用促進了纖維的降解[18]。本試驗中，Ⅱ+IV、Ⅱ+V組合pH值均顯著高于各單一菌株，說明Ⅱ+IV、Ⅱ+V在促進瘤胃乳酸利用菌增長或促進纖維降解方面存在復(fù)合效應(yīng)，能夠進一步緩解瘤胃pH值的降低，對維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要作用。

表3 酵母菌及其組合對體外發(fā)酵VFA的影響Table 3 Effects of yeasts and their combinations on VFA fermentation in vitro

2株酵母組合對底物降解率較單菌差異較小，這可能由于體外培養(yǎng)時間過短無法準(zhǔn)確評價酵母組合對底物纖維降解程度的影響[19]。Emmanuel等[20]、Gaafar等[21]試驗表明，酵母菌能夠刺激微生物生長，使瘤胃中的NH3大量轉(zhuǎn)化為微生物蛋白質(zhì)。本試驗中，2株酵母Ⅲ+IV、IV+V組合NH3-N濃度顯著低于各單一菌株，MCP含量顯著高于其中一株單菌，說明Ⅲ+IV、IV+V菌株組合在促進瘤胃微生物生長方面具有復(fù)合效應(yīng)，能夠使瘤胃中的NH3大量轉(zhuǎn)化為微生物蛋白質(zhì)，從而降低NH3-N濃度。

Lynch等[22]研究表明，在瘤胃微生物發(fā)酵苜蓿草的過程中添加活性酵母菌，能夠使甲烷產(chǎn)量降低20 %。Chaucheyras等[23]、Mwenya等[24]同樣發(fā)現(xiàn)，日糧中添加酵母可降低甲烷產(chǎn)量，并認(rèn)為其作用機制可能與氫利用的轉(zhuǎn)移有關(guān)。本試驗中，Ⅱ+IV、Ⅱ+V組合產(chǎn)氣量均顯著低于各單一菌株，甲烷產(chǎn)量顯著低于Ⅱ，與IV、V相比也有低的趨勢，說明菌株組合在減少甲烷產(chǎn)生方面存在復(fù)合效應(yīng)。

瘤胃VFA的產(chǎn)量和組成是評價瘤胃發(fā)酵方式和發(fā)酵能力的直接指標(biāo)。Erasmus等[25]在奶牛日糧中添加酵母制劑可以增加丙酸含量、降低乙丙比。同樣，鄧露芳[26]、Mutsvangwa等[27]研究發(fā)現(xiàn)，添加益生菌可促進丙酸比提高，乙酸比降低，乙丙比降低。本試驗中，2株組合酵母在乙酸、丙酸和異丁酸的比例以及乙丙比方面較單一菌株無顯著差異。3株酵母組合Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V較組內(nèi)各單一及2株組合菌存在極顯著降低乙酸比例、增加丙酸比例、降低乙丙比的現(xiàn)象，說明3株酵母組合Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V在調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵模式方面存在復(fù)合效應(yīng)。Thrune等[28]、周傳社等[29]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加酵母培養(yǎng)物可使TVFA含量下降。本試驗中，Ⅲ+IV、Ⅲ+V組合TVFA含量顯著低于各單一菌株，存在復(fù)合效應(yīng)。此外，本試驗中，3株酵母Ⅱ+Ⅲ+IV、Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V組合戊酸比例極顯著高于組內(nèi)各單一及2株酵母菌組合，其來源一方面由碳水化合物合成；另一方面來自脯氨酸、精氨酸、賴氨酸和蛋氨酸的降解產(chǎn)物[30]，說明3株菌組合Ⅱ+Ⅲ+IV、Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V在促進戊酸形成方面存在復(fù)合效應(yīng)。

4 結(jié)論

本試驗發(fā)現(xiàn)，高精料條件下不同酵母組合對瘤胃發(fā)酵影響不同，在維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面，Ⅱ與IV和V存在復(fù)合效應(yīng)；Ⅲ和IV、IV和V在降低NH3-N濃度方面存在復(fù)合效應(yīng)。在調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵模式方面，Ⅱ、Ⅲ和V以及Ⅱ、IV和V之間存在復(fù)合效應(yīng)，乙酸比例及乙丙比均顯著低于組內(nèi)各單一及2株組合菌，丙酸比例均顯著高于組內(nèi)各單一及2株組合菌；Ⅱ、Ⅲ和IV在戊酸形成方面存在復(fù)合效應(yīng)。其中，Ⅱ+IV、Ⅱ+V組合在維持瘤胃pH值、穩(wěn)定瘤胃內(nèi)環(huán)境方面效果顯著，是高精料條件下較為優(yōu)良的酵母組合菌株。