王 珣，柯 旋，張遠(yuǎn)恒，張 馳，孫斯琴

武漢市第三醫(yī)院(武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院)1. 心內(nèi)科、2. 放射科，湖北 武漢 430061；3. 武漢市普仁醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430080

流行病學(xué)調(diào)查表明，糖尿病患者心血管疾病患病率是非糖尿病人群心血管疾病的2～3倍[1]，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥之一，研究DCM發(fā)病機(jī)制對(duì)尋找防治DCM的方法具有重要意義。近年來(lái)研究表明，自噬現(xiàn)象和DCM關(guān)系密切。在糖尿病轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，自噬是上調(diào)的，過表達(dá)Beclin-1促進(jìn)過度自噬，導(dǎo)致了心肌肥厚加重，提示過度自噬導(dǎo)致了DCM。我們前期研究建立的DCM大鼠模型中心肌自噬是降低的，而且心肌纖維化明顯[2]。

所謂自噬，就是通過激活自噬相關(guān)蛋白誘導(dǎo)自噬發(fā)生，降解細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)壽命蛋白、損傷蛋白及細(xì)胞器，并對(duì)降解后成分再利用[3]。生理?xiàng)l件下的自噬作為細(xì)胞應(yīng)激的保護(hù)機(jī)制，處于一種持續(xù)的低水平狀態(tài)，然而，環(huán)境非理性的變化會(huì)導(dǎo)致自噬過度激活，引起細(xì)胞程序性死亡。對(duì)于心肌細(xì)胞而言，適度的自噬對(duì)其功能維持起著重要作用，但也可能會(huì)引起心肌疾病[4]。

乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)最先發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)細(xì)胞合成的神經(jīng)遞質(zhì)，后來(lái)人們逐漸認(rèn)識(shí)到，ACh在非神經(jīng)組織如上皮、內(nèi)皮、間皮等細(xì)胞中廣泛存在。通過自分泌或旁分泌作用，ACh可參與自身和臨近細(xì)胞基本功能的調(diào)節(jié)，如增殖、分化、凋亡、分泌、黏附、免疫功能等。心肌細(xì)胞可合成、釋放ACh，同樣，心肌細(xì)胞也分布著各種ACh受體(M、N受體)。研究表明，ACh激活M受體促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬，可減少缺氧/復(fù)氧過程中心肌凋亡[5]。但對(duì)于神經(jīng)遞質(zhì)在DCM中的作用不甚明確，既然自噬在DCM中有重要意義，而且ACh可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬活性，那么ACh是否在DCM發(fā)生、發(fā)展中有一定的作用？本研究建立高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型，探討ACh能否改善高糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷，并探究自噬在其中的作用及其機(jī)制，為治療DCM提供新的治療途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 大鼠心肌細(xì)胞系H9c2細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2試劑 ACh、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、雷帕霉素(rapamycin，Rap)、AICAR(AMPK激活劑)，購(gòu)自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清，購(gòu)自ScienCell公司；β-actin抗體、二抗，購(gòu)自中杉金橋公司；LC3、Beclin-1、Bcl-2、Bax、p62抗體，購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；AMP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)、p-AMPK、p-mTOR、mTOR抗體，購(gòu)自Abcam公司；MTT、ATP、BCA試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3儀器 生物潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Forma公司)；倒置生物顯微鏡(日本Olympus公司)；全波段酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；全套蛋白電泳電轉(zhuǎn)裝置(美國(guó)Bio-Rad公司)；超薄切片儀(德國(guó)Leica公司)；透射電鏡(日本JEOL公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組將H9c2心肌細(xì)胞復(fù)蘇后，在含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基2～3 d更換1次，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，消化收集細(xì)胞進(jìn)行傳代，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為7～15代細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為6組：(1)對(duì)照組(control)：用正常濃度葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2細(xì)胞72 h；(2)高糖(high glucose，HG)組：用含終濃度為30、17 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基[6]培養(yǎng)H9c2細(xì)胞72 h；(3)不同濃度ACh組：在含有30 mmol·L-1葡萄糖的心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中，同時(shí)分別加入10-6、10-5、10-4nmol·L-1的ACh培養(yǎng)H9c2細(xì)胞72 h；(4)HG+3-MA組：在終濃度為30 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)基中，同時(shí)加入2 mmol·L-1的3-MA，培養(yǎng)H9c2細(xì)胞72 h;(5)HG+ACh+Rap組：在終濃度為30 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)基中，同時(shí)加入50 nmol·L-1的Rap及10-4nmol·L-1的ACh，培養(yǎng)H9c2細(xì)胞72 h;(6)HG+ACh+AICAR組：在終濃度為30 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)基中同時(shí)加入10-4nmol·L-1的ACh及0.5 mmol·L-1AICAR[7]，培養(yǎng)H9c2細(xì)胞72 h。3-MA及Rap濃度借鑒于我們前期的實(shí)驗(yàn)研究[8]。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期細(xì)胞鋪板，每孔約104個(gè)細(xì)胞，每個(gè)藥物濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔和對(duì)照孔，藥物處理結(jié)束后，加入10 μL MTT溶液，4 h后，加入150 μL二甲基亞砜充分溶解結(jié)晶，利用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm處測(cè)量吸光度值(OD)。細(xì)胞相對(duì)活性=(藥物組OD平均值-空白組OD值平均值)/(對(duì)照組OD值平均值-空白組OD值平均值)。

1.4 ATP含量的檢測(cè)按BCA蛋白提取試劑盒提取總蛋白，計(jì)算蛋白濃度，利用ATP試劑盒提供的ATP標(biāo)準(zhǔn)品制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)樣品稀釋成不同濃度梯度，向96孔板中加入待測(cè)樣品，混勻后，用化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定相對(duì)光單位(relative light unit, RLU)值，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品中ATP的濃度，根據(jù)蛋白濃度，將ATP的濃度換算成μmol·g-1蛋白的形式。

1.5 Western blot檢測(cè)取出藥物處理后的H9c2細(xì)胞，在冷的RIPA蛋白裂解液中充分裂解。將裂解物離心后，收集上清液進(jìn)行蛋白分析，應(yīng)用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)量蛋白濃度。取20 μg蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到NC膜或PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h，隨后加入一抗(LC3、Beclin-1、Bcl-2、Bax、p62、p-mTOR、mTOR的稀釋比例均為1 ∶1 000，p-AMPK、AMPK稀釋比例為1 ∶2 000，β-actin稀釋比例為1 ∶10 000)，4 ℃孵育過夜，用PBST清洗干凈后，放入二抗中室溫孵育2 h，用ECL曝光顯色，利用ImageJ軟件分析結(jié)果，檢測(cè)蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.6 透射電鏡觀察細(xì)胞自噬體將處理的H9c2細(xì)胞用2.5%戊二醛固定2 h，然后用1%鋨酸固定液固定2～3 h，最后用0.1 mol·L-1磷酸漂洗液漂洗15 min，共3次，依次經(jīng)不同濃度梯度的乙醇脫水后，將其包埋在環(huán)氧樹脂中。使用超薄切片儀切成70 nm，并用含3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。透射電鏡觀察拍片。對(duì)于自噬體的定量分析，每組檢查10個(gè)隨機(jī)區(qū)域。

2 結(jié)果

2.1 高糖抑制H9c2細(xì)胞自噬如Fig 1所示，與對(duì)照組相比，高糖組(17、30 mmol·L-1)H9c2細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcelin-1的表達(dá)降低，p62表達(dá)升高(P<0.01)。透射電鏡觀察細(xì)胞自噬體數(shù)目顯示，與對(duì)照組相比，高糖組(17、30 mmol·L-1)自噬小體數(shù)目明顯減少(P<0.01)。

2.2 ACh抑制H9c2細(xì)胞自噬通過以上實(shí)驗(yàn)，確定高糖濃度30 mmol·L-1用于以下實(shí)驗(yàn)。如Fig 2所示，與對(duì)照組相比，高糖(30 mmol·L-1)環(huán)境中H9c2心肌細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcelin-1的蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，p62表達(dá)升高(P<0.05)；ACh(10-6、10-5、10-4nmol·L-1)處理，可降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcelin-1表達(dá)，增加p62表達(dá)(P<0.01)。

2.3 ACh增加高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性Fig 3的MTT結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，高糖組細(xì)胞活性降低(P<0.01)；相比于高糖組，ACh組細(xì)胞活性明顯增加，且ACh濃度大于10-4nmol·L-1差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞內(nèi)ATP含量檢測(cè)顯示，相比于對(duì)照組，高糖組細(xì)胞內(nèi)ATP含量明顯降低(P<0.05)；相比于高糖組，ACh組細(xì)胞內(nèi)ATP含量明顯增加，且ACh濃度大于10-4nmol·L-1差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 1 Autophagy in H9c2 cells inhibited by high glucose n=3)

A: Expressions of LC3, Beclin-1, and p62 in cardiomyocytes; B: Transmission electron microscopy (scale bar: 2 μm, red arrow indicates autophagosomes).**P<0.01vscontrol.

2.4 ACh抑制自噬保護(hù)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷根據(jù)上述細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)及ATP含量測(cè)定，ACh濃度為10-4nmol·L-1用于以下實(shí)驗(yàn)。Fig 4的Western blot結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，高糖組Bax/Bcl-2比值升高(P<0.01)；相比于高糖組，HG+ACh組及HG+3-MA組Bax/Bcl-2比值均降低(P<0.01)；相比于HG+ACh組，Ach+Rap組Bax/Bcl-2比值反而升高(P<0.01)。

Fig 2 Expressions of LC3, Beclin-1 and p62 in H9c2 cells n=3)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsHG

Fig 3 H9c2 cell activity under high glucose

A: Relative cell viability in each group; B: Relative ATP content in each group.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsHG.

Fig 4 Expressions of Bax, Bcl-2 in H9c2 cells n=3)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsHG;△△P<0.01vsHG+ ACh

2.5 ACh通過AMPK-mTOR信號(hào)通路抑制自噬如Fig 5所示，相比于對(duì)照組，高糖組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，p-AMPK/AMPK比值下降,p-mTOR/mTOR比值上升(P<0.01)；相比于高糖組，HG+ACh組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，p-AMPK/AMPK比值下降(P<0.01)，而p-mTOR/mTOR比值上升(P<0.01)；相比于HG+Ach組，HG+ACh+AICAR組p-AMPK/AMPK比值上升，而p-mTOR/mTOR比值下降，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上升(P<0.01)。提示ACh抑制自噬時(shí)，伴有p-AMPK/AMPK比值的下降及p-mTOR/mTOR比值的上升，而利用AMPK激活劑AICAR上調(diào)AMPK信號(hào)通路，可部分上調(diào)自噬水平。

3 討論

在臨床上，DCM是一個(gè)排除性診斷，不易被診斷，當(dāng)糖尿病患者出現(xiàn)心血管并發(fā)癥，并診斷為DCM時(shí)，提示患者預(yù)后差。大量研究已證實(shí),糖尿病可影響糖代謝及脂代謝，從脂質(zhì)毒性、糖毒性、氧化應(yīng)激增強(qiáng)、線粒體功能失常、炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等多個(gè)方面損傷心肌細(xì)胞，導(dǎo)致DCM的發(fā)生發(fā)展。因此，尋找治療DCM新的治療靶點(diǎn)極具意義。有研究表明，自噬參與糖尿病微血管及大血管并發(fā)癥的發(fā)生與進(jìn)展[2,9-10]，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，ACh可調(diào)控AMPK途徑介導(dǎo)的細(xì)胞自噬，影響心肌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型，在細(xì)胞水平探究了ACh在其中的作用及機(jī)制。

與既往的研究一致[6]，本研究再次證實(shí)高糖可抑制心肌細(xì)胞自噬，利用自噬抑制劑3-MA抑制自噬水平，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡水平反而下降，提示高糖抑制細(xì)胞自噬對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷是一種保護(hù)效應(yīng)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，ACh可增加高糖狀態(tài)下心肌細(xì)胞活性，并伴隨有細(xì)胞內(nèi)ATP含量升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ACh抑制自噬水平，作用類似自噬抑制，ACh處理后抑制心肌細(xì)胞自噬，可減少高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而在ACh處理后再利用Rap處理，反而出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡的增加。而Zhao等[11]的研究表明，ACh可促進(jìn)缺氧復(fù)氧過程中心肌細(xì)胞自噬，減少缺氧復(fù)氧造成的心肌損傷。之所以存在ACh既可抑制心肌細(xì)胞自噬，也可促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬，我們推測(cè)其原因可能與建立的細(xì)胞損傷模型不同有關(guān)。生理狀態(tài)下，細(xì)胞自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一種適應(yīng)性機(jī)制，在不同的應(yīng)激條件下，自噬水平的高低對(duì)細(xì)胞存活是一把雙刃劍。因此，可能存在ACh在不同條件下，以不同的方式調(diào)控自噬活性，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。

Fig 5 Expressions of LC3, p-AMPK, AMPK, p-mTOR, mTOR in H9c2 cells n=3)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsHG;△△P<0.01vsHG+ ACh

在饑餓、缺血、缺氧、氧化應(yīng)激等營(yíng)養(yǎng)或能量限制條件下，會(huì)誘導(dǎo)自噬水平升高。鑒于葡萄糖剝奪(營(yíng)養(yǎng)限制條件)能夠誘導(dǎo)自噬，高葡萄糖(營(yíng)養(yǎng)過剩的條件)會(huì)抑制心肌細(xì)胞中的自噬并不奇怪。自噬可在胰腺β-細(xì)胞中保護(hù)其免受糖尿病誘導(dǎo)的氧化損傷，因此，可以理解的是，在本研究中抑制的自噬并不會(huì)導(dǎo)致高葡萄糖毒性。相反，這種適應(yīng)性反應(yīng)構(gòu)成了在高葡萄糖暴露期間，促進(jìn)心肌細(xì)胞存活的機(jī)制的一部分。支持我們的結(jié)果有，葡萄糖輸注減少了肝臟中的自噬，伴隨著脂多糖誘導(dǎo)的全身性炎癥的減弱[12]。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了一個(gè)事實(shí)，即自噬可能是保護(hù)性的，也可能是有害的，這取決于細(xì)胞類型和細(xì)胞環(huán)境。因此，必須單獨(dú)確定在不同病理?xiàng)l件下自噬的功能意義。

自噬受哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、NF-κB等眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)，其中mTOR是最重要的一條通路，負(fù)向調(diào)控自噬活性。PI3K/Akt與AMPK是mTOR上游的兩條通路, 且相互密切聯(lián)系[13]。抑制PI3K/Akt可降低mTOR的活化，從而促進(jìn)自噬的發(fā)生[14]，AMPK與之相反[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，ACh是通過抑制AMPK，促進(jìn)mTOR的活化，從而抑制自噬。

自噬在病理狀態(tài)下作為一種適應(yīng)性應(yīng)激來(lái)維持整體的平衡，作為細(xì)胞應(yīng)對(duì)不良環(huán)境的一種防御機(jī)制。目前研究最多的是巨自噬。在腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、衰老、心血管疾病、感染等眾多疾病的病理生理過程中，自噬都起了重要作用，調(diào)控自噬可能成為防治相關(guān)疾病潛在靶點(diǎn)之一。本研究發(fā)現(xiàn)，ACh可作為干預(yù)靶點(diǎn)調(diào)節(jié)自噬活性，ACh通過抑制自噬，降低高葡萄糖毒性，進(jìn)一步推測(cè)，ACh可能通過自噬途徑參與眾多疾病的發(fā)生、發(fā)展。此外，離體細(xì)胞模型與體內(nèi)模型存在差異，因此，本課題組擬在糖尿病心肌病動(dòng)物模型展開進(jìn)一步研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在江西省高血壓研究所完成，在此感謝張婉老師及曾俊義老師在實(shí)驗(yàn)中給予的幫助與支持。)