王 龍，葛 劍，陳謙學(xué)，田道鋒，劉寶輝，晏 彪

(1. 武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 武漢 430060；2. 武警湖北總隊醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 武漢 430061；3. 湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

學(xué)習(xí)能力障礙(learning disability，LD)常出現(xiàn)在兒童期，又稱兒童學(xué)習(xí)困難，最近美國《精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊(第五版)》將其定義為神經(jīng)發(fā)育障礙，是世界各國普遍存在并引起廣泛關(guān)注的兒童疾病之一。有研究指出[1]，約3%的神經(jīng)發(fā)育障礙是由環(huán)境污染物暴露直接引起，另有25%是由廣泛界定的環(huán)境因素與遺傳易感性之間的相互作用導(dǎo)致。鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)作為一類典型的具有神經(jīng)毒性的持久性有機污染物，可通過日常飲食、吸入和皮膚接觸等途徑影響兒童的學(xué)習(xí)、記憶能力[2-3]。Cho等[2]的流行病學(xué)研究提示，DBP暴露可明顯降低小學(xué)生的學(xué)習(xí)成績和智商。一些研究證實，孕期DBP暴露可持續(xù)誘發(fā)兒童的LD[3]。Wojtowicz等[4]研究揭示，DBP暴露所致兒童LD的關(guān)鍵在于：DBP可通過孕婦胎盤和嬰幼兒血腦屏障，導(dǎo)致腦海馬神經(jīng)元凋亡，但其機制有待進(jìn)一步闡明。

細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)主要包括ERK1和ERK2，與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等重要生理過程存在聯(lián)系[5]，ERK1/2通路活化可能參與DBP誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡。有資料顯示[6]，ERK1/2通路活化涉及的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡與線粒體通透性增加(胞內(nèi)Ca2+增加)、細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)釋放、caspase-3的激活密切相關(guān)。尼莫地平(nimodipine，Nim)作為第2代二氫吡啶類Ca2+拮抗劑，在腦相關(guān)疾病治療中具有較大的臨床應(yīng)用價值。近年資料表明[7]，Nim對神經(jīng)元有直接作用，具有神經(jīng)和精神藥理活性，可保護(hù)和促進(jìn)記憶、智力恢復(fù)，但目前尚未見報道Nim對DBP所致學(xué)習(xí)記憶障礙的作用。本實驗擬探究Nim對DBP所致KM小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的拮抗作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器DBP(純度≥99.6%，貨號84742)、Nim (純度≥98%，貨號N149)、Hoechst 33258熒光染料，均購自美國Sigma-Aldrich；TUNEL細(xì)胞凋亡原位試劑盒(南京凱基生物技術(shù)公司)；鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)、鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶II(calcium/calmodulin dependent protein kinase II，CaMKII)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、Cyt C、caspase-3酶聯(lián)免疫試劑盒，均購自美國eBioscience；β-actin抗體(Abcam公司，貨號ab37168)；ERK(貨號4695)、p-ERK(貨號4370)抗體，均購自國CST。EthoVision XT Version 12.0實驗動物神經(jīng)行為記錄儀(荷蘭Noldus)；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國Bio-Rad)；凝膠成像及分析系統(tǒng)(英國Syngene)；RM2245切片機(德國LEICA)；BX53顯微鏡(日本Olympus)；ELx800酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek)。

1.2 實驗動物SPF級♂KM小鼠，體質(zhì)量(18±1)g，購自湖北省實驗動物研究中心，許可證號：SYXK(鄂)2015-0052。所有小鼠均飼養(yǎng)于SPF級標(biāo)準(zhǔn)動物房內(nèi)，提供自由飲食，房間溫度保持在(20～25) ℃，濕度為50%～70%，光照/黑暗周期為12 h。

1.3 實驗分組與處理36只KM小鼠隨機分成4組：對照組、50 mg·kg-1DBP組、2 mg·kg-1Nim組、50 mg·kg-1DBP+2 mg·kg-1Nim組(DBP+Nim)。DBP先用Tween 80助溶，再用生理鹽水稀釋至終濃度，DBP劑量及灌胃給藥途徑參考Yan等報道[8]，Nim劑量及腹腔給藥途徑參考Karande等報道[9]。給藥處理如下：實驗期間每天上午固定時間給藥，DBP組小鼠每天灌胃50 mg·kg-1DBP 1次，給藥體積為10 mL·kg-1，連續(xù)給藥28 d；DBP+Nim組小鼠每天腹腔注射2 mg·kg-1Nim 1次，30 min后再灌胃給予50 mg·kg-1DBP，連續(xù)給藥28 d。

1.4 指標(biāo)與方法

1.4.1Morris水迷宮(morris water maze, MWM)實驗 MWM實驗選用直徑為100 cm圓桶形水箱，水深20 cm，水溫控制范圍(23±1)℃，逃逸平臺位于SW象限的正中央，距離水面0.5 cm。小鼠的游泳軌跡等數(shù)據(jù)由水池正上方的攝像機記錄，影像數(shù)據(jù)記錄傳入計算機，通過EthoVision軟件分析。小鼠于給藥d 22～26進(jìn)行水迷宮定向航行訓(xùn)練，d 27為遺忘期，d 28撤掉平臺后，進(jìn)行空間探索實驗，檢測小鼠尋找目標(biāo)平臺的時間，記為逃逸潛伏期(s)。

1.4.2腦海馬CA1區(qū)切片病理學(xué)觀察 實驗取材的腦海馬組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石臘包埋切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色和Nissl染色，顯微鏡下觀察腦海馬組織CA1的病理變化，拍片(×400倍)。

1.4.3腦海馬CA1區(qū)Hoechst 33258熒光染色 腦海馬組織CA1區(qū)切片經(jīng)工作濃度為5 mg·L-1Hoechst 33258熒光染液，染色5 min，用PBS水洗兩遍后，置于熒光顯微鏡下觀察，拍片(×200倍)。

1.4.4腦海馬CA1區(qū)TUNEL染色 腦海馬組織CA1區(qū)切片用二甲苯浸洗2次，每次5 min，脫蠟后用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)至水，經(jīng)蛋白酶K工作液(20 mg·L-1) 在室溫下處理15 min，PBS漂洗2次；加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液(陰性對照組僅加50 μL熒光素標(biāo)記的dUTP液)于標(biāo)本上，暗濕盒中37 ℃孵育60 min。PBS漂洗后，加100 μL DAB混合液(50 μL DAB+50 μL DAB底物緩沖液+50 μL H2O2+950 μL三蒸水)10 min顯色，熒光顯微鏡下觀察，拍片(×200倍)。

1.4.5Western blot檢測腦海馬ERK、p-ERK蛋白表達(dá) 腦海馬用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗2～3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器中。加入10倍于組織體積的蛋白提取試劑，冰浴徹底勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，振蕩。冰浴30 min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保勻漿液完全裂解。4 ℃、12 000 r·min-1離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液，測定樣品蛋白濃度。10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，加一抗封閉緩沖液室溫封閉1 h，再分別加入一抗4 ℃過夜。用TBST洗膜3次，每次5 min，再加入二抗，室溫孵育30 min，ECL顯影。膠片掃描后，用AlphaEaseFC軟件分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.4.6腦海馬CaM、CaMKII、PKC、Cyt C及caspase-3水平的檢測 小鼠經(jīng)稱重后，取腦海馬組織置于預(yù)冷PBS(pH 7.4)中漂洗，濾紙拭干，稱重后置于勻漿器中，加預(yù)冷的PBS制成10%勻漿液，4 ℃、10 000×g離心10 min后取上清，待檢。取腦海馬組織勻漿上清液，按照ELISA試劑盒說明，測定CaM、CaMKII、PKC、Cyt C及caspase-3水平。

2 結(jié)果

2.1 Nim改善DBP對小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響與對照組比較，50 mg·kg-1DBP組小鼠的潛伏期明顯上升(P<0.05)；與50 mg·kg-1DBP組比較，DBP+Nim組小鼠的潛伏期有一定程度下降。小鼠60 s內(nèi)尋找逃逸平臺的游泳軌跡熱點見Fig 1，DBP組小鼠的軌跡較少出現(xiàn)在目標(biāo)象限，游泳路徑?jīng)]有目的性，且無規(guī)律；而DBP+Nim組小鼠在目標(biāo)象限的軌跡有所增加。

2.2 Nim降低DBP暴露后小鼠腦海馬的Ca2+水平各組小鼠腦海馬組織的CaM、CaMKII及PKC水平可反映胞內(nèi)Ca2+水平。Tab 1結(jié)果顯示，與對照組比較，DBP組小鼠腦海馬CaM、CaMKII水平下降，PKC水平上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與DBP組比較，DBP+Nim組小鼠腦海馬組織中CaM、CaMKII水平明顯上升(P<0.01，P<0.05)，PKC水平明顯下降(P<0.05)。

Fig 1 Heatmap and latency of Morris water maze test of mice in different treatment groups

A: Control group; B: 50 mg·kg-1DBP group; C: 2 mg·kg-1Nim group; D: DBP+Nim group; E: Latency of Morris water maze test.

Tab 1 Levels of CaM, CaMKII and PKC in hippocampus of KM mice in different treatment groups n=9)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsDBP

2.3 Nim降低DBP暴露后小鼠腦海馬p-ERK1/2的表達(dá)ERK未活化時分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，活化形式磷酸化ERK1/2 (p-ERK1/2)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，p-ERK1/2是ERK通路活化的主要標(biāo)志。如Fig 2所示，各組小鼠腦海馬ERK表達(dá)未見明顯變化；與對照組比較，DBP組小鼠腦海馬p-ERK表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01)；與DBP組比較，DBP+Nim組小鼠腦海馬p-ERK1/2表達(dá)量下降 (P<0.05)。

2.4 Nim減輕DBP暴露后小鼠腦海馬CA1神經(jīng)細(xì)胞的損傷腦系數(shù)的結(jié)果見Tab 2，與對照組比較，DBP組小鼠腦系數(shù)明顯降低(P<0.05)，經(jīng)Nim處理后，DBP+Nim組小鼠腦系數(shù)有一定程度增加。Fig 3的HE染色結(jié)果顯示，對照組小鼠腦海馬CA1區(qū)的錐體神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)保持完好，呈多角形且排列整齊，邊緣清晰；DBP組小鼠腦海馬出現(xiàn)了損傷特征，錐體細(xì)胞腫脹變形，頂狀樹突變短或消失；經(jīng)Nim處理后，DBP+Nim組小鼠腦海馬錐體細(xì)胞雖仍表現(xiàn)出一定程度的損傷，但組織病理學(xué)的改變?nèi)缒[脹變形、頂狀樹突變短或消失等損傷細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。Nissl染色結(jié)果顯示，與對照組比較，DBP組小鼠腦海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Nissl小體大量缺失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞；經(jīng)Nim處理后，DBP+Nim組Nissl小體缺失的現(xiàn)象在給予Nim保護(hù)后有所緩解。

Fig 2 ERK and p-ERK1/2 expression levels in hippocampus of KM mice in different treatment groups by Western blot n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsDBP

Tab 2 Brain coefficient of KM mice in different treatment groups n=9)

*P<0.05vscontrol

2.5 Nim拮抗DBP所致小鼠腦海馬CA1神經(jīng)細(xì)胞的凋亡由Tab 3可知，與對照組比較，DBP組小鼠腦海馬Cyt C、caspase-3水平明顯上升(P<0.01)；經(jīng)Nim處理后，與DBP組比較，DBP+Nim組小鼠腦海馬Cyt C、caspase-3水平明顯下降(P<0.05)。Fig 4的Hoechst 33258染色結(jié)果顯示，DBP組小鼠腦海馬細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光，數(shù)量明顯多于對照組，且熒光強度有明顯性增加；經(jīng)Nim處理后，DBP+Nim組小鼠腦海馬CA1區(qū)熒光強度有所減弱。Fig 5的TUNEL染色結(jié)果顯示，DBP組小鼠腦海馬CA1區(qū)帶有TUNEL熒光標(biāo)記的神經(jīng)元，其數(shù)量明顯多于對照組；經(jīng)Nim處理后，與DBP組比較，DBP+Nim組小鼠腦海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)量有一定程度減少，凋亡水平明顯降低。

Fig 3 Hippocampal CA1 of KM mice in different treatment groups by HE and Nissl staining (×400)

Tab 3 Levels of Cyt C and caspase-3 in hippocampus of KM mice in different treatment groups n=9)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsDBP

Fig 4 Hippocampal CA1 of KM mice in different treatment groups by Hoechst 33258 fluorescence staining (×200)

A: Control group; B: 50 mg·kg-1DBP group; C: 2 mg·kg-1Nim group; D: DBP+Nim group. Yellow arrow: dense granular and massive fluorescence was seen in the nucleus or cytoplasm.

Fig 5 Hippocampal CA1 of KM mice in different treatment groups by TUNEL staining (scale bar=50 μm)

A: Control group; B: 50 mg·kg-1DBP group; C: 2 mg·kg-1Nim group; D: DBP+Nim group. Red arrow: apoptotic cells with TUNEL-labeled (green).

3 討論

細(xì)胞凋亡在神經(jīng)元發(fā)育過程中起重要作用，凋亡缺陷可能是各種神經(jīng)退行性疾病的基礎(chǔ)。大腦是接受外源刺激的一個重要靶器官，而海馬是學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵功能區(qū)，海馬神經(jīng)元的損傷、凋亡以及信號通路的激活等，在導(dǎo)致LD過程中起重要作用[10]。既往研究表明[6]，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高是細(xì)胞發(fā)生凋亡的一個重要條件。另有研究報道[7]，Nim是一種L型鈣通道拮抗劑，能減少病理狀態(tài)下過度的Ca2+，可明顯減輕受試動物的空間學(xué)習(xí)記憶障礙，抑制海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的丟失。本實驗結(jié)果表明，DBP可增加Ca2+濃度，激活PKC-ERK1/2通路，導(dǎo)致KM小鼠腦海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生凋亡，而Nim作為Ca2+拮抗劑可減少Ca2+濃度，從而抑制ERK1/2通路的活化，降低DBP對KM小鼠腦組織CA1區(qū)神經(jīng)元的損傷及凋亡，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

體內(nèi)外研究均顯示[11]，胞內(nèi)Ca2+濃度與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。CaM是細(xì)胞內(nèi)一種鈣結(jié)合蛋白，能敏感地捕獲Ca2+，每4個Ca2+可被一分子CaM結(jié)合；當(dāng)胞內(nèi)游離的Ca2+濃度增加，無活性的CaM結(jié)合Ca2+而被活化，激活相關(guān)靶蛋白，從而參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞短期和長期記憶等生命活動。CaMKII廣泛分布在神經(jīng)組織中，在海馬內(nèi)約占蛋白總量的1%～2%，它的主要作用是能感受突觸后鈣離子水平的變化，維持突觸可塑性和發(fā)揮學(xué)習(xí)記憶功能。PKC是G蛋白偶聯(lián)受體系統(tǒng)中的效應(yīng)物，在未受刺激的細(xì)胞中，PKC主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，呈非活性構(gòu)象；一旦有第二信使如Ca2+的存在，PKC將成為膜結(jié)合的酶，一方面它能激活細(xì)胞質(zhì)中的酶如ERK1/2，參與生化反應(yīng)的調(diào)控，同時也能作用于細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子，參與基因表達(dá)的調(diào)控，在細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活等方面具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，50 mg·kg-1DBP組小鼠腦組織CaM、CaMKII含量明顯降低，同時PKC水平增加，提示DBP可致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，這與蔣昀等[12]報道一致。

ERK1/2通路活化與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的海馬組織神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有重要關(guān)聯(lián)[13]。Zhai等[13]指出，ERK1/2參與海馬突觸可塑性的形成，在學(xué)習(xí)記憶過程中起重要作用。另一方面，ERK1/2通路可被細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號所激活，直接參與內(nèi)源性細(xì)胞凋亡過程。本實驗結(jié)果表明，50 mg·kg-1DBP組小鼠腦海馬組織p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組，提示DBP可激活ERK1/2通路。

研究證實[14]，Cyt C釋放是早期凋亡發(fā)生的重要事件，caspase-3是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行分子，兩者水平可反映早期細(xì)胞凋亡程度。本實驗結(jié)果表明，50 mg·kg-1DBP組小鼠腦海馬組織Cyt C、caspase-3含量明顯高于對照組；HE與Nissl染色結(jié)果也顯示，50 mg·kg-1DBP組小鼠腦海馬組織CA1區(qū)錐體神經(jīng)元出現(xiàn)了損傷，伴有Nissl小體缺失。根據(jù)Hoechst 33258以及TUNEL熒光結(jié)果進(jìn)一步顯示，DBP暴露后，小鼠腦海馬組織CA1區(qū)的細(xì)胞凋亡水平明顯升高。以上結(jié)果提示，DBP暴露可激活caspase-3細(xì)胞凋亡途徑，導(dǎo)致小鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞的損傷及凋亡。

腦海馬CA1區(qū)的病理學(xué)改變與小鼠神經(jīng)行為學(xué)的變化密切相關(guān)，MWM實驗主要用于測試實驗動物對空間位置感和方向感(空間定位)的學(xué)習(xí)記憶能力。本實驗MWM的結(jié)果表明，50 mg·kg-1DBP組小鼠的逃逸潛伏期明顯高于對照組，出現(xiàn)在目標(biāo)象限的游泳軌跡較少，而經(jīng)Nim處理后，DBP+Nim組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有一定程度改善。其他動物實驗表明，Nim可通過抑制胞內(nèi)Ca2+濃度的增加，下調(diào)全腦放療后細(xì)胞凋亡，減輕遲發(fā)性認(rèn)知功能障礙，對記憶障礙有改善作用[15]。本實驗結(jié)果提示，Nim可能在一定程度上拮抗DBP引起的胞內(nèi)Ca2+濃度的增加，緩解DBP誘導(dǎo)的腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，DBP暴露可影響小鼠腦海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+相關(guān)蛋白，上調(diào)p-ERK1/2表達(dá)，誘發(fā)或加重小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。Nim作為一種選擇型鈣拮抗劑，能改善DBP所致小鼠的學(xué)習(xí)記憶下降，或與其可拮抗胞內(nèi)Ca2+濃度增加，降低DBP暴露后小鼠腦組織p-ERK1/2、caspase-3水平有關(guān)。

(致謝：本實驗動物給藥操作在湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院完成，感謝暨南大學(xué)中醫(yī)學(xué)院陳剛教授的指導(dǎo)。)