王紅艷，孔維祎，王竹青，孟德龍，丁 強，王鴻磊

(中國農(nóng)業(yè)大學 煙臺研究院，山東 煙臺 264670)

香蘑屬(Lepista)隸屬于真菌界擔子菌門(Basidiomycota)層菌綱(Hymenomycetes)傘菌目(Agaricales)口蘑科(Tricholomataceae)[1-2]。我國主要的種類有花臉香蘑(Lepistasordida)、紫丁香蘑(L.nuda)和灰紫香蘑(L.glaucocana)等，均是名貴的食藥用菌，廣泛分布于我國的遼寧、黑龍江、吉林、河南、江蘇、四川、內(nèi)蒙古及山東等地[3-4]。

花臉香蘑為香蘑屬的1個種，其味道鮮美，營養(yǎng)豐富，子實體蛋白質(zhì)含量高，氨基酸種類全，人體所必需的8種氨基酸含量豐富[5-7]，脂肪含量較低[8]，并含有豐富的人體必需的微量元素和維生素[9-11]，其發(fā)酵液具有抗菌[12]、抗氧化及抗腫瘤等活性[13-14]；子實體有養(yǎng)血、養(yǎng)神、補肝等功效[12]，經(jīng)常食用對于久病體虛、貧血崩漏和神疲健忘等癥狀具有良好的治療效果[15]。目前花臉香蘑主要來自于野外采集，價格昂貴，人工栽培鮮有報道。筆者所在實驗室自山東省煙臺市牟平區(qū)林區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)并采集到1株香蘑屬真菌，為進一步確定其分類學地位，利用ITS和28S rDNA的D1D2區(qū)序列測定對其進行分子生物學鑒定并對其菌絲形態(tài)及生物學特征進行研究，以期為該菌株的人工栽培及其進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 野生香蘑屬真菌 采自山東省煙臺市牟平區(qū)，保存于中國農(nóng)業(yè)大學煙臺研究院食用菌菌種選育實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基 1)PDA培養(yǎng)基。土豆浸粉6 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。2)碳源利用培養(yǎng)基。土豆浸粉10 g，MgSO40.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，碳源分別為2%的葡萄糖、蔗糖、玉米粉、淀粉、纖維素、乳糖、紅糖和糖蜜。3)氮源利用培養(yǎng)基。糖蜜20 g，MgSO40.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，氮源分別為1%的豆餅粉、酵母膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、土豆浸粉和0.5%的硝酸銨、硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀。4)無機鹽利用培養(yǎng)基。糖蜜20 g，豆餅粉10 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，無機鹽分別為0.1‰的MgSO4、MnSO4、NaCl、CaSO4、FeSO4、Na2SO4、K2HPO4、KH2PO4、ZnSO4和K2SO4。

1.2 方法

1.2.1 野生香蘑屬真菌的采集、分離、菌落和菌絲形態(tài)觀察及形態(tài)學初步鑒定 2017年9月，于山東省煙臺市牟平區(qū)林地內(nèi)發(fā)現(xiàn)野生香蘑屬子實體數(shù)個，將子實體表面消毒，取菌柄和菌蓋交界處的菌絲組織，接種于PDA培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)得到野生香蘑屬真菌菌種。拍照并通過觀察子實體的分布情況，菌蓋的大小、顏色、形狀、質(zhì)地和表面性狀，菌褶著生方式，菌柄著生方式。將菌種接種于PDA培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。挑取菌絲體，用棉蘭、結(jié)晶紫等染色液制作水浸片，觀察菌絲和鎖狀聯(lián)合。根據(jù)該菌種的形態(tài)學指標對其進行形態(tài)學初步鑒定。

1.2.2 野生香蘑屬的分子鑒定

1)基因組的提取和ITS序列測定。將菌種(編號為HL-ND)接種PDA培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)，刮取菌絲體，利用CTAB法提取基因組DNA。使用真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通過引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)擴增基因組DNA的ITS序列，利用28S rDNA通用引物NL1(GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG)、NL4(GGTCCGTGTTTCAAGACGG)擴增基因組28S rDNA的D1、D2區(qū)。PCR產(chǎn)物送生工生物(上海)股份有限公司測序[16]。

2)序列測定和比對。根據(jù)ITS、28S rDNA D1D2區(qū)測序結(jié)果，登陸NCBI進行Blast序列相似性比，用MEGA5.0進行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌種的生物學特性

1)最佳生長溫度測定。用直徑8 mm打孔器打取菌落邊緣的菌絲塊，接種于PDA培養(yǎng)基平板表面，分別于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃培養(yǎng)，定期測量菌落直徑，計算菌絲生長量。菌絲生長量=(菌落直徑-接種塊直徑)/2。

2)最佳pH測定。用直徑8 mm打孔器打取菌落邊緣的菌絲塊，接種于pH分別為4.5、5、6、7、8、9、10和11的PDA培養(yǎng)基平板表面，定期測量菌落直徑，計算菌絲生長量。

3)最佳碳源、氮源和無機鹽測定。用直徑8 mm打孔器打取菌落邊緣的菌絲塊，分別接種于碳源利用培養(yǎng)基、氮源利用培養(yǎng)基和無機鹽利用培養(yǎng)基表面，25℃培養(yǎng)，定期測量菌落直徑，計算菌絲生長量。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生香蘑屬真菌菌株的形態(tài)學鑒定

圖1可知，采集到的野生香蘑屬菌株子實體呈紫色、肉質(zhì)，直徑2～3 cm，叢生，平展，中部稍凹陷，水漬狀；菌柄中生，與菌蓋同色；菌褶淡紫色，稀疏，不等長。從圖2可知，花臉香蘑HL-ND菌落呈圓形，蔓延生長，棉絮狀，質(zhì)地疏松，菌落表面同心輪紋。菌落淡紫色，中心顏色略深于四周，不產(chǎn)水溶性色素。經(jīng)顯微鏡觀察，花臉香蘑HL-ND菌絲多分支，直徑(3.5±1.5)μm，常自體纏繞或相互纏繞形成菌絲束或菌絲球，具鎖狀聯(lián)合。經(jīng)形態(tài)學初步鑒定為花臉香蘑，命名為HL-ND。

圖1 采集的野生香蘑屬真菌子實體Fig.1 Collected fruiting bodies of Lepista sp.

圖2 花臉香蘑 HL-ND的菌落及菌絲形態(tài)Fig.2 Mycelium morphology and colony of L.sordida HL-ND

2.2 花臉香蘑的分子鑒定

從圖3～4可知，HL-ND菌株的ITS序列和28S rDNA的D1D2區(qū)序列與花臉香蘑(Lepistasordida)的相關(guān)序列的相似率均高達99%，結(jié)合形態(tài)學指標鑒定其為花臉香蘑。

圖3 HL-ND 菌株根據(jù) ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed from ITS sequences of HL-ND strain

圖4 HL-ND 菌株根據(jù)28S rDNA D1D2區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed from sequences of 28S rDNA D1D2 region of HL-ND strain

2.3 花臉香蘑 HL-ND菌株的生物學特性

從圖5可知，花臉香蘑在不同溫度、pH、碳源、氮源及無機鹽下的生長情況。

2.3.1 生長溫度 隨著溫度的升高，花臉香蘑HL-ND菌絲生長速度逐漸加快，至25℃時，菌絲生長速度達到最大，為(3.507 7±0.060 5)mm/d。當溫度超過25℃，菌絲生長速度極劇下降。當培養(yǎng)溫度為35℃時，平板培養(yǎng)10 d，菌絲塊仍沒有萌發(fā)的跡象。故花臉香蘑HL-ND菌絲最佳生長溫度為25℃。

2.3.2 pH 花臉香蘑HL-ND菌絲在pH 4.5～11均能生長，在pH 7.0～9.0的堿性環(huán)境下菌絲生長速度較快，其最適pH為8.0，當pH超過10.0菌絲生長速度迅速下降。

2.3.3 碳源 碳源是花臉香蘑最重要的營養(yǎng)物質(zhì)，可為花臉香蘑的生長提供碳元素和能量，花臉香蘑能利用的碳源較廣泛。無論是大分子的纖維素、淀粉，還是小分子的葡萄糖均能被菌絲吸收。但花臉香蘑HL-ND菌絲在不同碳源培養(yǎng)基上生長速度不同，其中，在葡萄糖和乳糖為碳源的培養(yǎng)基上生長速度最慢，在以糖蜜、紅糖、蔗糖、纖維素、淀粉及玉米粉為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長速度比較接近，以糖蜜為碳源時菌絲生長最快，糖蜜為最佳碳源。

2.3.4 氮源 花臉香蘑HL-ND菌株可以利用多種有機氮源和無機氮源。無機氮源以硝酸鉀的生長速率最快，氯化銨次之，硫酸銨最慢。有機氮源較易于被HL-ND菌株利用，其生長速率明顯高于無機氮源，其中以土豆浸粉最佳。

圖5 不同溫度、pH、碳源、氮源及無機鹽下花臉香蘑的菌絲生長量Fig.5 Growth of L.sordida with different temperature,pH,carbon source,nitrogen source and inorganic salt

2.3.5 無機鹽 無機鹽是食用菌菌絲的重要組成成份，很多無機鹽是酶的激活劑，對菌絲的生長具有促進作用，但是也有一些無機鹽對菌絲的生長具有抑制作用。培養(yǎng)基內(nèi)添加不同的無機鹽對花臉香蘑HL-ND菌絲的生長有不同的作用，硫酸亞鐵為菌絲生長最佳無機鹽，其對菌絲的生長具有明顯的促進作用，而培養(yǎng)基內(nèi)添加0.1%的硫酸鉀、硫酸鈉后，花臉香蘑菌絲生長明顯受到抑制。其余無機鹽的加入對花臉香蘑菌絲的生長沒有明顯的作用。

3 結(jié)論和討論

研究分離的香蘑屬真菌菌種經(jīng)ITS、26S rDNA的D1、D2區(qū)序列測定，配合形態(tài)學特征鑒定為花臉香蘑，其菌落淡紫色，菌絲多分支，具鎖狀聯(lián)合，常纏繞成束狀或球狀。菌種最佳生長溫度為25℃，最佳生長pH 7.0～9.0，最佳碳源、氮源、無機鹽分別為糖蜜、土豆浸粉和硫酸鋅。

花臉香蘑具有氣味香濃、味道鮮美、色澤宜人及營養(yǎng)豐富等特點，是一種珍稀的藥食兩用真菌，一直以來倍受食用菌愛好者青睞。但花臉香蘑野外資源稀少，不能滿足人們的需要，故開展花臉香蘑人工栽培勢在必行。本研究豐富了花臉香蘑的種質(zhì)資源，研究了菌絲的生長條件和營養(yǎng)要求，可為今后的人工栽培提供參考。