蔡龔莉，陳 裕，林舒婷，朱丹丹，董怡文，李 寧，劉瀟璇*

(中國(guó)藥科大學(xué) 1天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2藥物科學(xué)研究院高端藥物制劑與材料研究中心，南京 210009)

RNA干擾(RNA interference,RNAi)在1998年由Fire等[1]首次報(bào)道，它是一種由小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)觸發(fā)的特異性基因沉默效應(yīng)。在RNAi過(guò)程中，雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)分子被RNase-Ⅲ類(lèi)核酸內(nèi)切酶Dicer切割成21～23個(gè)核苷酸的雙鏈siRNA，該雙鏈siRNA和Argonaute 2(Ago2)蛋白、核酸內(nèi)切酶Dicer、解旋酶結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)，雙鏈解開(kāi)，其中正義鏈被降解，反義鏈保留并激活RISC。當(dāng)反義鏈通過(guò)Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與特定的靶mRNA結(jié)合時(shí)，mRNA被RISC中的Dicer切割后降解，無(wú)法進(jìn)一步翻譯成蛋白質(zhì)并導(dǎo)致基因沉默。此外，RNAi具有級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，在mRNA降解后，活化的RISC再參與另一個(gè)mRNA降解循環(huán)[2](圖1)?；诖耍芯咳藛T設(shè)計(jì)特定序列的siRNA用于特異性沉默致病基因，從而達(dá)到治療的目的。2018年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了首款siRNA藥物patisiran(Onpattro?)用于治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性(hATTR)引起的周?chē)喟l(fā)性神經(jīng)疾病(polyneuropathy)，與此同時(shí)還有多種siRNA藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)[3]?；趕iRNA的RNAi療法具有很多優(yōu)點(diǎn)，比如良好的安全性、特異性和高效性。但siRNA分子本身的一些特點(diǎn)，如血漿半衰期短、易被核酶降解、易被腎臟清除、帶負(fù)電荷難以自發(fā)穿過(guò)細(xì)胞膜等，使其具有較差的成藥性。因此，提高siRNA成藥性的關(guān)鍵在于發(fā)展安全高效的siRNA遞送系統(tǒng)。

目前常用的siRNA遞送載體可分為病毒類(lèi)載體和非病毒類(lèi)載體。病毒載體具有很高的轉(zhuǎn)染效率，但是自身的安全性不佳，如有免疫原性等，且生產(chǎn)成本高昂，限制了其臨床應(yīng)用[4]。相比之下，非病毒載體具有低免疫原性、低生產(chǎn)成本和低毒性等優(yōu)點(diǎn)，吸引了研究人員的廣泛關(guān)注。這些非病毒載體主要分為陽(yáng)離子脂質(zhì)和陽(yáng)離子聚合物兩大類(lèi)。陽(yáng)離子載體通過(guò)靜電相互作用結(jié)合siRNA形成穩(wěn)定納米粒，保護(hù)siRNA在體循環(huán)過(guò)程中不被降解，將其遞送至靶向部位，促進(jìn)細(xì)胞攝取，并在siRNA/載體復(fù)合物內(nèi)化后，通過(guò)內(nèi)涵體逃逸并有效將siRNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中，參與RNAi過(guò)程，產(chǎn)生有效的基因沉默效應(yīng)(圖2)。

Figure 1Mechanism of RNA interference

Figure 2Non-viral vectors mediated siRNA delivery

在眾多siRNA遞送系統(tǒng)中，樹(shù)形分子作為聚合物載體家族中特殊的一員，因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)引起研究人員的廣泛關(guān)注[5]。樹(shù)形分子概念在20世紀(jì)80年代被首次提出，其英文名(dendrimer)來(lái)源于希臘語(yǔ)“dendron”(tree的意思)和“meros”(part的意思)。樹(shù)形分子是一類(lèi)球狀納米級(jí)大分子，其結(jié)構(gòu)通常可以分為3個(gè)部分：中心核、分支單元和末端基團(tuán)[6]。中心核位于樹(shù)形分子的最里層。分支單元(重復(fù)單元)在中心核和分子表面之間，是由核出發(fā)經(jīng)過(guò)重復(fù)的反應(yīng)得到的一系列徑向分布的同心層，每一層叫做樹(shù)形分子的一代(Generation,G)。分支單元有著精確的結(jié)構(gòu)，作為樹(shù)形分子的骨架參與其三維結(jié)構(gòu)的變化。末端基團(tuán)處于樹(shù)形分子表面，可經(jīng)修飾后實(shí)現(xiàn)不同的用途，在基因或藥物遞送時(shí)起著關(guān)鍵的作用(圖3)。

Figure 3Dendrimer structure

樹(shù)形分子一般通過(guò)發(fā)散法、收斂法或發(fā)散收斂法合成[5](圖4)。發(fā)散法是指從樹(shù)形分子的中心核出發(fā)，通過(guò)與分支單元的重復(fù)反應(yīng)，逐步增加分子大小和代數(shù)。這種方法的缺陷在于隨著樹(shù)形分子代數(shù)的增長(zhǎng)，由于表面的空間位阻效應(yīng)使得反應(yīng)難以進(jìn)行完全，導(dǎo)致產(chǎn)生含有缺陷的副產(chǎn)物分子，這種缺陷會(huì)隨著代數(shù)積累而且產(chǎn)物難以純化。為了確保反應(yīng)的進(jìn)行和防止副產(chǎn)物的生成，往往需要加入過(guò)量的反應(yīng)物，但這又會(huì)增加純化難度。與之相對(duì)的收斂法則是指從樹(shù)形分子結(jié)構(gòu)的表面出發(fā)，通過(guò)與分支單元逐步反應(yīng)，形成樹(shù)狀單元，再將樹(shù)狀單元與樹(shù)形分子的中心核連接形成完整的樹(shù)形分子。這種方法跟發(fā)散方法相比反應(yīng)易于控制，副產(chǎn)物容易分離，能有效降低產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)缺陷，可以得到較為完整的分子，但同樣由于空間位阻效應(yīng)很難得到高代分子。而發(fā)散收斂法是通過(guò)發(fā)散法合成樹(shù)形分子的中心核，然后通過(guò)收斂法合成樹(shù)狀單元，再將中心核與樹(shù)狀單元連接得到完整的樹(shù)形分子。這種方法結(jié)合發(fā)散和收斂?jī)煞N合成方法優(yōu)點(diǎn)，可以縮短合成高代樹(shù)形分子的時(shí)間，同時(shí)這種方法還可以通過(guò)可控的方式將不同的樹(shù)狀單元結(jié)合到一起，從而得到具有特殊用途的非對(duì)稱樹(shù)形結(jié)構(gòu)。

Figure 4Strategies of dendrimer synthesis

A:Divergent approach;B:Convergent approach;C:Double-stage convergent approach

樹(shù)形分子具有一些獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)[6]，例如具有精確的結(jié)構(gòu)，良好的單分散性；同時(shí)，樹(shù)形分子表面具有大量的末端基團(tuán)，可以與溶劑或其他分子發(fā)生多位點(diǎn)的相互作用，使得樹(shù)形分子具有較好的溶解性和反應(yīng)活性；此外，樹(shù)形分子的末端基團(tuán)還可以進(jìn)行多種修飾，賦予樹(shù)形分子不同的性質(zhì)，例如修飾特異性配體可以增強(qiáng)樹(shù)形分子的靶向遞送能力。

目前樹(shù)形分子在siRNA遞送領(lǐng)域的應(yīng)用日益增多[7]，聚酰胺-胺類(lèi)[poly(amidoamine)，PAMAM]、聚丙烯亞胺類(lèi)[poly(prophylenimine)，PPI]、肽類(lèi)(peptide dendrimer)、聚甘油類(lèi)(polyglycerol dendrimer，PG)、碳硅烷類(lèi)(carbosilane dendrimer，CBD)、三嗪類(lèi)(triazine dendrimer)、兩親類(lèi)(amphiphilic dendrimer)等多種樹(shù)形分子被開(kāi)發(fā)用于遞送siRNA，其中PAMAM是目前研究得最深入和最廣泛的一類(lèi)。本文將對(duì)以上不同類(lèi)別的樹(shù)形分子在siRNA遞送方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 聚酰胺-胺類(lèi)樹(shù)形分子(PAMAM)

在眾多樹(shù)形分子載體中，聚酰胺-胺類(lèi)樹(shù)形分子是研究得最早和最深入的一類(lèi)。Tomalia等[8]在1985年首次合成了PAMAM樹(shù)形分子(圖5-A)，傳統(tǒng)的PAMAM樹(shù)形分子以氨為核，通過(guò)與丙烯酸甲酯的Michael加成和與乙二胺的酰胺化交替反應(yīng)合成。在PAMAM樹(shù)形分子遞送siRNA的過(guò)程中，陽(yáng)離子PAMAM樹(shù)形分子表面大量的胺基基團(tuán)可以通過(guò)靜電相互作用結(jié)合siRNA并形成穩(wěn)定納米粒，從而有效保護(hù)siRNA，避免其被核酶降解。然后，siRNA/樹(shù)形分子復(fù)合物納米粒經(jīng)內(nèi)吞途徑被細(xì)胞攝取，被內(nèi)化的納米粒主要聚集在酸性細(xì)胞器中，如內(nèi)涵體和溶酶體。樹(shù)形分子結(jié)構(gòu)中存在大量叔胺基團(tuán)，使其具備很強(qiáng)的pH緩沖能力，可通過(guò)“質(zhì)子海綿”效應(yīng)實(shí)現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸，從而促進(jìn)siRNA的釋放，達(dá)到基因沉默效果[9]。

研究表明，相比于完整結(jié)構(gòu)的樹(shù)形分子，部分降解的樹(shù)形分子具有更高的基因遞送效率[10]。2005年Kang等[11]嘗試通過(guò)結(jié)構(gòu)完整的G5PAMAM樹(shù)形分子來(lái)遞送siRNA，但并沒(méi)有觀察到基因沉默效果，他們猜測(cè)是siRNA在胞內(nèi)的不完全釋放導(dǎo)致的。而基于PAMAM樹(shù)形分子的商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑PolyFect?和SuperFect?的活性成分是部分降解的PAMAM樹(shù)形分子，可能是因?yàn)椴糠纸到獾臉?shù)形分子具有更開(kāi)放和柔順的結(jié)構(gòu)，使其更易于與核酸和水分子作用，有利于核酸的結(jié)合和釋放。這些部分降解的PAMAM樹(shù)形分子通常是將結(jié)構(gòu)完整的樹(shù)形分子進(jìn)行堿水解或熱降解的方法得到[10]。眾所周知，高代樹(shù)形分子(如G5)的合成和純化過(guò)程都相當(dāng)耗時(shí)耗力，通過(guò)合成完整的高代樹(shù)形分子再進(jìn)行降解得到部分降解的產(chǎn)物用于高效的基因遞送，是一種不經(jīng)濟(jì)又不環(huán)保的方法。因此，在2006年，Zhou等[12]就報(bào)道了以三乙醇胺(TEA)為核的一類(lèi)具有柔順結(jié)構(gòu)的PAMAM樹(shù)形分子(圖5-B)，與傳統(tǒng)氨為核的PAMAM樹(shù)形分子相比，這種具有開(kāi)放和柔順結(jié)構(gòu)的樹(shù)形分子的空間位阻較低，利于其與siRNA的結(jié)合，同時(shí)水分子也更容易進(jìn)入樹(shù)形分子內(nèi)部，增加內(nèi)部叔胺質(zhì)子化的可能，促進(jìn)siRNA 借助“質(zhì)子海綿”效應(yīng)的釋放。實(shí)驗(yàn)證明，該結(jié)構(gòu)柔順型樹(shù)形分子能夠和siRNA結(jié)合形成大小約為70 nm的穩(wěn)定納米粒，保護(hù)siRNA并促進(jìn)其細(xì)胞攝取[13]。在前列腺腫瘤細(xì)胞模型[13]中，這類(lèi)結(jié)構(gòu)柔順的PAMAM樹(shù)形分子在其代數(shù)等于或高于5時(shí)都能有效遞送siRNA，降低熱休克蛋白27(Hsp27)的表達(dá)并產(chǎn)生Caspase依賴的抗腫瘤活性。此外，這類(lèi)樹(shù)形分子還能有效地將siRNA遞送到人類(lèi)T細(xì)胞和原代PBMC細(xì)胞中，并產(chǎn)生顯著的基因沉默效應(yīng)[14]。同時(shí)，該樹(shù)形分子能夠在人源化小鼠艾滋病模型中進(jìn)行系統(tǒng)給藥，遞送可以同時(shí)靶向艾滋病毒復(fù)制和感染的siRNA并發(fā)揮基因沉默效應(yīng)，有效預(yù)防宿主CD4+T細(xì)胞耗竭和病毒逃逸，產(chǎn)生顯著抗HIV活性[14]。最新研究表明，該類(lèi)樹(shù)形分子還可將siRNA靶向遞送至卵巢癌干細(xì)胞，顯著抑制卵巢癌干細(xì)胞的擴(kuò)張、黏連、侵襲轉(zhuǎn)移和腫瘤的生長(zhǎng)[15]。除了上述的前列腺癌，艾滋病和卵巢癌疾病模型，這類(lèi)新型結(jié)構(gòu)柔順的樹(shù)形分子介導(dǎo)的小RNA治療還成功地應(yīng)用于肝癌[16]、膠質(zhì)瘤[17]等疾病模型中。

PAMAM樹(shù)形分子表面具有豐富的末端基團(tuán)，圍繞其末端基團(tuán)可以進(jìn)行多種修飾，這些修飾可以降低siRNA/樹(shù)形分子復(fù)合物在遞送過(guò)程中的毒性、提高其靶向性、增加細(xì)胞攝取等。

陽(yáng)離子樹(shù)形分子經(jīng)部分修飾后可有效降低其細(xì)胞毒性。高代PAMAM樹(shù)形分子攜帶較多的表面正電荷，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)過(guò)多的正電荷會(huì)增加納米復(fù)合物的細(xì)胞毒性，因此可以通過(guò)對(duì)其正電荷表面進(jìn)行一定程度的修飾，在保持其遞送活性的同時(shí)降低其細(xì)胞毒性。例如聚乙二醇(PEG)作為在改善陽(yáng)離子載體細(xì)胞毒性中被開(kāi)發(fā)最多的聚合物，能夠極大地降低陽(yáng)離子樹(shù)形分子的細(xì)胞毒性。在G5或G6PAMAM上進(jìn)行8%的PEG修飾(圖6-A)[18]可以提高轉(zhuǎn)染效率、降低毒性，其遞送siRNA產(chǎn)生的基因沉默效應(yīng)要遠(yuǎn)優(yōu)于未修飾的樹(shù)形分子，與商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(Lipo)效果相當(dāng)。

Figure 5PAMAM dendrimers

A:Amine (NH3) core PAMAM dendrimer;B:Triethanolamine (TEA) core PAMAM dendrimer

在樹(shù)形分子表面進(jìn)行特定修飾可以實(shí)現(xiàn)siRNA的靶向遞送，有效減少非特異性遞送，提高遞送效率并降低毒性。透明質(zhì)酸是一種天然的具有細(xì)胞特異性的聚合物，其受體CD44在MCF-7和MDA-MB-231等細(xì)胞系中高度表達(dá)，使用透明質(zhì)酸修飾樹(shù)形分子可以通過(guò)靶向效應(yīng)增加siRNA在相應(yīng)腫瘤細(xì)胞中的遞送效率。Ma等[19]通過(guò)修飾透明質(zhì)酸四糖簇的G4PAMAM樹(shù)形分子實(shí)現(xiàn)siRNA的成功遞送(圖6-E)。與透明質(zhì)酸寡糖相比，透明質(zhì)酸四糖簇與受體CD44的結(jié)合能力增強(qiáng)，修飾后的樹(shù)形分子與siRNA形成復(fù)合物，并進(jìn)一步通過(guò)CD44介導(dǎo)的胞吞作用大大增加其細(xì)胞攝取，從而發(fā)揮顯著的基因沉默效應(yīng)。除此之外，一些靶向肽和某些腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的受體之間存在著特異性相互作用，也常用于修飾樹(shù)形分子末端以促進(jìn)siRNA/樹(shù)形分子復(fù)合物的靶向遞送。如Liu等[20]將雙靶向肽RGDK引入到結(jié)構(gòu)柔順型PAMAM樹(shù)形分子的siRNA遞送系統(tǒng)中，其中RGD可以通過(guò)與腫瘤血管上過(guò)表達(dá)的ανβ3整合素的相互作用靶向腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞，增加siRNA/樹(shù)形分子復(fù)合物在腫瘤部位的富集，減少非特異性遞送；RGDK則可與腫瘤細(xì)胞表面的Nrp-1受體結(jié)合，增加細(xì)胞攝取。

對(duì)樹(shù)形分子表面進(jìn)行特定的修飾還可以提高細(xì)胞對(duì)復(fù)合物的攝取，從而提高siRNA的基因沉默效率。眾所周知，含有豐富精氨酸的細(xì)胞穿透肽能夠促進(jìn)細(xì)胞攝取，因?yàn)樵谏項(xiàng)l件下，每個(gè)精氨酸殘基都含有一個(gè)帶正電荷的胍基，胍基可以通過(guò)其平面結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜相互作用，從而促進(jìn)膜的滲透。因此，將精氨酸修飾于樹(shù)形分子的末端(圖6-B)[21]，能夠增強(qiáng)樹(shù)形分子與siRNA的相互作用，促進(jìn)細(xì)胞攝取，提高轉(zhuǎn)染效率。在樹(shù)形分子上進(jìn)行脂質(zhì)修飾是另一種增加攝取的方法。脂質(zhì)修飾后可以平衡樹(shù)形分子的陽(yáng)離子電荷和脂質(zhì)含量，促進(jìn)納米粒的細(xì)胞攝取和內(nèi)涵體逃逸，進(jìn)而優(yōu)化siRNA遞送及轉(zhuǎn)染效率。C12飽和烷基鏈修飾的PAMAM(圖6-C)[22]介導(dǎo)的siRNA的遞送中，即使在低siRNA劑量(10 nmol/L)下，也具有80%的基因沉默效果。同時(shí)，脂質(zhì)修飾后的樹(shù)形分子還可以實(shí)現(xiàn)抗腫瘤藥物和siRNA共同遞送治療多藥耐藥。Biswas等[23]將1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇(DOPE-PEG)連在PAMAM樹(shù)形分子上所得的共聚物能夠自組裝成尺寸低于100 nm的膠束，其對(duì)阿霉素和siRNA的遞送能力都有了極大的提高。除了細(xì)胞滲透肽和脂質(zhì)之外，全氟烷基化合物因其獨(dú)特的性質(zhì)也常被用于修飾樹(shù)形分子以提高遞送效率。含氟化合物既疏水又疏脂，同時(shí)存在獨(dú)特的氟氟相互作用，有利于siRNA/樹(shù)形分子復(fù)合物在低N/P比條件下實(shí)現(xiàn)最佳的轉(zhuǎn)染效果，提高其血清穩(wěn)定性，增加細(xì)胞攝取，促進(jìn)內(nèi)涵體逃逸。He等[24]在不同代數(shù)PAMAM樹(shù)形分子上綴合雙尾氟化合物2-氯-4,6-雙[(全氟己基)丙氧基]-1,3,5-三嗪(CBT)顯示出高siRNA遞送功效，并且所修飾的樹(shù)形分子在其最佳轉(zhuǎn)染條件下表現(xiàn)出最低的細(xì)胞毒性。Wang等[25]合成的七氟丁酸修飾的PAMAM也表現(xiàn)出優(yōu)異的siRNA遞送能力(圖6-D)，在低劑量條件下其基因沉默效應(yīng)甚至優(yōu)于商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑Lipo。

2 聚丙烯亞胺類(lèi)樹(shù)形分子(PPI)

聚丙烯亞胺類(lèi)樹(shù)形分子是另一類(lèi)常用的樹(shù)形分子(圖7)。它主要以胺為起始原料，通過(guò)與丙烯腈的Michael加成、腈基還原成氨基兩步反應(yīng)的交替進(jìn)行得到。Buhleier等[26]在1978年首次報(bào)道了PPI的合成，但存在反應(yīng)不完全、副反應(yīng)多、產(chǎn)率低等問(wèn)題。在此基礎(chǔ)上，研究人員優(yōu)化了PPI的制備方法[27-28]，在胺和丙烯腈的Michael加成反應(yīng)中加入水，使得過(guò)量的丙烯腈能夠與水形成共沸物并除去，腈基末端的化合物可經(jīng)水洗滌純化得到；隨后，使用Raney/Cobalt對(duì)腈基進(jìn)行加氫還原，過(guò)濾后得到純產(chǎn)物。優(yōu)化后的制備方法顯著降低了產(chǎn)物的純化難度、減少了副反應(yīng)、提高了產(chǎn)率，可應(yīng)用于大量生產(chǎn)。PPI結(jié)構(gòu)中含有大量胺基基團(tuán)，包括末端的伯胺和內(nèi)部的叔胺，因此也適用于siRNA的遞送。為了提高PPI的遞送效率和靶向能力，研究人員常常在PPI結(jié)構(gòu)中修飾靶向基團(tuán)，期望通過(guò)受體-配體的特異性識(shí)別，以提高靶向遞送能力。Tietze 等[29]開(kāi)發(fā)了基于麥芽糖修飾的PPI樹(shù)形分子的載體系統(tǒng)，其中，載體中的單抗片段可靶向識(shí)別腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)的表皮生長(zhǎng)因子受體Ⅲ(EGFRvIII)，實(shí)現(xiàn)siRNA的高效靶向遞送。此外，促黃體激素釋放激素(LHRH)也常用于修飾PPI以提高載體的靶向性。如LHRH修飾后的PPI靶向卵巢癌細(xì)胞遞送DJ-1 siRNA，顯著降低了卵巢癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力[30]。在利用LHRH提高PPI遞送系統(tǒng)靶向性的同時(shí)，Taratula等[31]同時(shí)在PPI表面修飾了PEG，該策略有效提高了siRNA的血清穩(wěn)定性，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別和攝取，從而發(fā)揮基因沉默效應(yīng)，提高腫瘤治療的療效。

然而，在研究PPI的細(xì)胞毒性時(shí)發(fā)現(xiàn)，PPI樹(shù)形分子會(huì)改變A431和A549細(xì)胞的內(nèi)源基因表達(dá)[32]，因此，PPI可能會(huì)影響人類(lèi)固有基因的功能，這也大大地限制了PPI在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用。

Figure 6Surface-modified PAMAM dendrimers

A:PEG-modified PAMAM dendrimer;B:Arginine-modified PAMAM dendrimer;C:Lipid-modified PAMAM dendrimer;D:Fluorinated PAMAM dendrimer;E:Hyaluronic acid-modified PAMAM dendrimer

Figure 7Poly (propylene imine) dendrimer (PPI)

3 肽類(lèi)樹(shù)形分子

肽類(lèi)樹(shù)形分子在廣義上是指在中心核、分支單元或者末端基團(tuán)含有氨基酸或肽序的樹(shù)形分子，而在狹義上則是指樹(shù)形分子的整個(gè)結(jié)構(gòu)均由氨基酸構(gòu)成[33]，其中聚L-賴氨酸樹(shù)形分子(PLL)就是一種典型的肽類(lèi)樹(shù)形分子(圖8)。PLL由賴氨酸組成，一般以胺為核心，通過(guò)帶有保護(hù)基的賴氨酸之間的縮合-脫保護(hù)兩個(gè)交替的反應(yīng)，得到不同代數(shù)的PLL樹(shù)形分子[34]。PLL具有良好的生物相容性，可以在生物體內(nèi)經(jīng)過(guò)酶或者酸的作用發(fā)生降解[33]。雖然PLL表面的胺基在生理?xiàng)l件下便可發(fā)生質(zhì)子化攜帶正電荷，能與siRNA通過(guò)靜電相互作用形成復(fù)合物，但其結(jié)構(gòu)中不含有與PAMAM和PPI類(lèi)似的叔胺結(jié)構(gòu)，致使siRNA無(wú)法通過(guò)“質(zhì)子海綿”效應(yīng)從內(nèi)涵體中逃逸出來(lái)發(fā)揮基因沉默效應(yīng)[35]。研究人員開(kāi)始嘗試通過(guò)對(duì)PLL進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造以提高其siRNA遞送能力。例如，對(duì)PLL表面進(jìn)行脂質(zhì)修飾可以提高siRNA遞送能力，C18不飽和烷基鏈修飾的PLL樹(shù)形分子在體內(nèi)表現(xiàn)出有效的RNA干擾能力而無(wú)明顯的細(xì)胞毒性[36]。同時(shí)，氟化修飾也能增強(qiáng)PLL的遞送能力。Cai等[37]設(shè)計(jì)了基于氟化G2PLL樹(shù)形分子遞送系統(tǒng)，可以提高siRNA在遞送過(guò)程中的生理穩(wěn)定性和血清抗性，促進(jìn)siRNA/樹(shù)形分子復(fù)合物的腫瘤內(nèi)富集、細(xì)胞內(nèi)化及內(nèi)涵體逃逸。

Figure 8Poly (L-lysine) dendrimer (PLL)

4 聚甘油類(lèi)樹(shù)形分子(PG)

聚甘油類(lèi)樹(shù)形分子的研究也較為廣泛，其分支單元為甘油，一般以醇為起始原料，通過(guò)醇的烯丙基化、烯丙基雙鍵的催化二羥基化兩步反應(yīng)交替可以得到[38]。陽(yáng)離子胺基末端的聚甘油樹(shù)形分子表現(xiàn)出良好的siRNA遞送能力。Haag課題組一直致力于聚甘油樹(shù)形分子的研究，F(xiàn)ischer等[39]設(shè)計(jì)了含有各種陽(yáng)離子胺基末端的聚甘油樹(shù)形分子，其中PG-NH2(圖9)在轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性之間表現(xiàn)出最佳平衡。PG-NH2可以通過(guò)將聚甘油樹(shù)形分子上的羥基以胺基替代得到。研究表明，PG-NH2中胺基取代程度對(duì)其遞送能力有著顯著影響，50%胺基取代的PG-NH2的核酸親和力最強(qiáng)。與此同時(shí)，體內(nèi)外轉(zhuǎn)染研究結(jié)果也表明，只有50%胺基取代的PG-NH2才能有效轉(zhuǎn)染siRNA[40]。為了進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率，Zeng等[41]還對(duì)PG-NH2進(jìn)行了進(jìn)一步的氨基酸修飾研究。通過(guò)在PG-NH2末端修飾不同種類(lèi)的氨基酸，同時(shí)調(diào)整氨基酸的組合、氨基酸的數(shù)量和PG-NH2的代數(shù)，發(fā)現(xiàn)組氨酸和色氨酸比例為3/1的雙功能化PG-NH2比未修飾的PG-NH2具有更高的遞送效率和更低的細(xì)胞毒性。這是因?yàn)榻M氨酸中的咪唑基團(tuán)在弱酸性條件下可質(zhì)子化，增加siRNA/樹(shù)形分子復(fù)合物的pH緩沖能力，從而促進(jìn)其內(nèi)涵體逃逸；同時(shí)咪唑基團(tuán)具有化學(xué)惰性，可提高其血清穩(wěn)定性[42]。疏水性氨基酸色氨酸則發(fā)揮與脂質(zhì)相似的作用，平衡樹(shù)形分子的電荷及疏水性，從而促進(jìn)細(xì)胞攝取，提高轉(zhuǎn)染效率。因此，氨基酸雙功能化修飾可達(dá)到協(xié)同增效的作用，進(jìn)一步增強(qiáng)PG-NH2的siRNA遞送效果。相似的，組氨酸與精氨酸比例為3/1的雙功能化的PG-NH2在NIH 3T3細(xì)胞系中也表現(xiàn)出高效的siRNA轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性(細(xì)胞存活率為90%)[43]。

Figure 9Polyglycerolamine dendrimer (PG-NH2)

5 碳硅烷類(lèi)樹(shù)形分子(CBD)

碳硅烷類(lèi)樹(shù)形分子具有一個(gè)含硅的核心，其骨架通常由碳碳鍵和碳硅鍵構(gòu)成，形成高度疏水的樹(shù)形分子結(jié)構(gòu)。它的合成通常以帶烯基的硅烷為中心核，與甲基二氯硅烷進(jìn)行硅氫加成反應(yīng)；隨后與格氏試劑反應(yīng)得到烯基末端樹(shù)狀物，兩步反應(yīng)交替進(jìn)行得到不同代數(shù)的樹(shù)形分子[44]。碳硅烷樹(shù)形分子表面連接銨鹽后(圖10)，可以通過(guò)靜電相互作用結(jié)合siRNA，用于siRNA遞送。Weber等[45]的研究表明，G2銨鹽末端的碳硅烷樹(shù)形分子可有效遞送siRNA。在對(duì)比氧硅鍵碳硅烷樹(shù)形分子(CBD-OS)和碳硅鍵碳硅烷樹(shù)形分子(CBD-CS)后發(fā)現(xiàn)，兩者都可有效遞送siRNA用于HIV基因治療[46]，但也都存在各自的不足，氧硅鍵在水溶液中不穩(wěn)定，容易緩慢發(fā)生水解，影響CBD-OS的廣泛應(yīng)用；CBD-CS不含氧硅鍵，相對(duì)較穩(wěn)定，但存在siRNA釋放困難的問(wèn)題[47]。此外，銨鹽末端的碳硅烷樹(shù)形分子表面帶有大量正電荷，在遞送過(guò)程中也可能帶來(lái)毒性問(wèn)題。為了降低其毒性，研究人員嘗試將銨鹽連接的一個(gè)甲基用羥甲基替代，發(fā)現(xiàn)樹(shù)形分子表面電荷略微降低，其毒性也隨之降低[48]；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)利用三甲基磷鹽替代銨鹽進(jìn)行修飾后得到的磷鹽末端的碳硅烷樹(shù)形分子具有相對(duì)較低的體內(nèi)毒性，在魚(yú)類(lèi)胚胎模型中其半數(shù)致死量(LD50)比其他陽(yáng)離子樹(shù)形分子高10倍以上[49]。

6 三嗪類(lèi)樹(shù)形分子

三嗪類(lèi)樹(shù)形分子是以鹵代1,3,5-三嗪環(huán)為分支單元，利用氨基化合物的氨基和鹵素之間的反應(yīng)，將三嗪環(huán)連接起來(lái)得到不同代數(shù)的樹(shù)形分子[50]。Merkel等[51]研究發(fā)現(xiàn)，三嗪類(lèi)樹(shù)形分子的中心核結(jié)構(gòu)、末端基團(tuán)和代數(shù)都會(huì)影響siRNA的遞送。其中剛性的G2三嗪類(lèi)樹(shù)形分子比柔性結(jié)構(gòu)類(lèi)似物表現(xiàn)出更好的基因沉默效應(yīng)；在剛性三嗪類(lèi)樹(shù)形分子上修飾精氨酸或者短鏈脂質(zhì)(圖11)可以促進(jìn)其內(nèi)涵體逃逸以及 siRNA在胞質(zhì)中釋放，從而有效提高了基因沉默效率。Pavan等[52]進(jìn)一步通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬研究了三嗪類(lèi)樹(shù)形分子與siRNA之間的相互作用，研究人員預(yù)期柔性結(jié)構(gòu)的三嗪類(lèi)樹(shù)形分子能夠利用其結(jié)構(gòu)的靈活性，增加樹(shù)形分子與siRNA的結(jié)合，但研究結(jié)果表明，柔性結(jié)構(gòu)的三嗪類(lèi)樹(shù)形分子反而形成了更緊密的球形構(gòu)象，弱化了樹(shù)形分子與siRNA 的結(jié)合。與其他類(lèi)型的樹(shù)形分子相比，三嗪類(lèi)樹(shù)形分子在siRNA遞送方面的應(yīng)用相對(duì)較少一些，進(jìn)一步的研究仍在進(jìn)行之中。

Figure 10Ammonium-terminating carbosilane dendrimer (CBD)

7 兩親類(lèi)樹(shù)形分子

在siRNA遞送中，樹(shù)形分子的代數(shù)與遞送效率有著直接關(guān)系，較高代數(shù)的樹(shù)形分子具有更好的siRNA結(jié)合能力，其遞送效率也較高。但因空間位阻等因素的影響，高代樹(shù)形分子的制備難度相對(duì)較大，批量化生產(chǎn)困難。為了解決樹(shù)形分子載體“高代高效但難制備”這一共性問(wèn)題，研究人員制備具有兩親性的較低代數(shù)的樹(shù)形分子，運(yùn)用自組裝的策略，使其組裝形成超分子樹(shù)形分子組裝體，以實(shí)現(xiàn)高效的siRNA遞送。

Figure 11Lipid-modified triazine dendrimer

Yu等[53]結(jié)合脂質(zhì)分子和樹(shù)形分子載體的優(yōu)勢(shì)設(shè)計(jì)了一系列低代數(shù)的兩親性PAMAM樹(shù)形分子，這類(lèi)樹(shù)形分子含有疏水性的烷基長(zhǎng)鏈和親水性的低代PAMAM樹(shù)形結(jié)構(gòu)(圖12-A)，這兩部分是通過(guò)click反應(yīng)連接到一起，在保留樹(shù)形分子結(jié)構(gòu)明確和獨(dú)特的多價(jià)特性優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，顯著降低制備難度；同時(shí)，兩親性樹(shù)形分子自組裝形成樹(shù)形分子納米膠束以模擬高代球型樹(shù)形分子，高效地將siRNA 遞送至人源的原代細(xì)胞和干細(xì)胞等多種類(lèi)型的細(xì)胞中，展現(xiàn)出優(yōu)異的siRNA遞送能力。深入的構(gòu)效關(guān)系研究表明此類(lèi)兩親性樹(shù)形分子結(jié)構(gòu)中的親水部分PAMAM的代數(shù)和疏水部分烷基鏈的長(zhǎng)度對(duì)遞送效率都有影響[54]。疏水鏈缺失或者以親水性PEG鏈替代疏水部分所構(gòu)建的樹(shù)形分子都不具備兩親性，無(wú)法自組裝形成膠束遞送siRNA；減少親水部分的末端胺基數(shù)量或者縮短疏水部分的烷基鏈長(zhǎng)度，也無(wú)法產(chǎn)生顯著的基因沉默效應(yīng)。其主要原因?yàn)镻AMAM代數(shù)過(guò)低，表面正電荷基團(tuán)偏少，則無(wú)法與siRNA形成有效的靜電相互作用；烷基鏈長(zhǎng)度太短，則組裝時(shí)的疏水相互作用也會(huì)減弱，無(wú)法與siRNA形成穩(wěn)定的組裝體；疏水鏈過(guò)長(zhǎng)則會(huì)使疏水作用增強(qiáng)，形成的復(fù)合物過(guò)于致密和穩(wěn)定，siRNA無(wú)法實(shí)現(xiàn)有效的胞內(nèi)釋放，導(dǎo)致其遞送效率也較低。在此構(gòu)效關(guān)系的研究基礎(chǔ)上，Liu等[55]進(jìn)一步調(diào)整疏水部分烷基鏈的數(shù)目構(gòu)建了一類(lèi)含有兩條烷基鏈的兩親性樹(shù)形分子(圖12-B)，這類(lèi)兩親性樹(shù)形分子自組裝形成納米囊泡結(jié)構(gòu)，但在與siRNA相互作用時(shí)能自適應(yīng)重排形成球形膠束結(jié)構(gòu)。這種從囊泡到膠束結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變可以實(shí)現(xiàn)末端正電荷基團(tuán)的最大化暴露，有利于與siRNA的靜電相互作用，從而更好地結(jié)合和保護(hù)siRNA。為了提高兩親性樹(shù)形分子的遞送效率，他們將精氨酸修飾于兩親性樹(shù)形分子的親水端以提高細(xì)胞對(duì)siRNA/樹(shù)形分子復(fù)合物的攝取，從而顯著增強(qiáng)其基因沉默效率[56]。為了更進(jìn)一步增加遞送系統(tǒng)的靶向性，Dong等[57]利用雙靶向肽RGDK對(duì)兩親性樹(shù)形分子遞送系統(tǒng)進(jìn)行修飾，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明使用此靶向遞送系統(tǒng)的siRNA有效劑量降低了91.7%(由3 mg/kg降低至0.25 mg/kg)。此外，Liu等[58]還設(shè)計(jì)了一種含氟bola型兩親性樹(shù)形分子(圖12-C)，在分子中引入縮硫醛鍵，能夠響應(yīng)于腫瘤細(xì)胞中高水平活性氧(ROS)，實(shí)現(xiàn)siRNA的按需遞送。同時(shí)，該分子結(jié)構(gòu)中的氟原子還可以實(shí)現(xiàn)氟譜示蹤樹(shù)形分子介導(dǎo)的siRNA遞送過(guò)程。

此外，這類(lèi)兩親性樹(shù)形分子結(jié)構(gòu)中疏水部分的存在使得這類(lèi)分子能夠用于疏水性藥物和基因藥物的共遞送，實(shí)現(xiàn)多種藥物協(xié)同治療。Li等[59]建立了腫瘤微環(huán)境敏感多肽(TMSP)修飾的兩親性樹(shù)形分子(G0-C14)遞送系統(tǒng)(圖12-D)，實(shí)現(xiàn)siRNA和紫杉醇的共遞送。TMSP由細(xì)胞穿透肽和屏蔽肽組成，其中屏蔽肽含有基質(zhì)金屬蛋白酶-2/9(MMP-2/9)敏感的肽段PVGLIG。TMSP被MMP-2/9活化后暴露細(xì)胞穿透肽部分，進(jìn)一步促進(jìn)納米復(fù)合物的細(xì)胞攝取，該共遞送系統(tǒng)在人黑素瘤中表現(xiàn)出協(xié)同治療的效果。

除此之外，其他種類(lèi)的樹(shù)形分子如聚甘油類(lèi)和碳硅烷類(lèi)也被設(shè)計(jì)成兩親性的結(jié)構(gòu)用于siRNA的遞送。研究人員構(gòu)建了不同代數(shù)的聚甘油兩親性樹(shù)形分子[60-61]，其疏水部分是C18疏水烷基鏈，親水部分的聚甘油表面修飾了不同數(shù)量的甘氨酸或N,N-二-(3-氨基丙基)-N-(甲基)胺(DAPMA)以通過(guò)靜電相互作用結(jié)合siRNA(圖13-A)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在疏水部分加入硫辛酸結(jié)構(gòu)使樹(shù)形分子可以自組裝形成生物交聯(lián)型膠束，在還原條件下交聯(lián)鍵斷裂實(shí)現(xiàn)siRNA的進(jìn)一步釋放[62]。疏水性碳硅烷和親水性PEG連接也可以形成新型兩親性雜交樹(shù)形分子(圖13-B)，可有效遞送siRNA至外周血單核細(xì)胞用于HIV治療[63]。

Figure 12Amphiphilic PAMAM dendrimers

A:Amphiphilic PAMAM dendrimer carrying a hydrophobic C18 alkyl chain;B:Amphiphilic PAMAM dendrimer carrying two hydrophobic C18 alkyl chains;C:Bola amphiphilic PAMAM dendrimer;D:G0-C14 amphiphilic PAMAM dendrimer

Figure 13Amphiphilic polyglycerol dendrimer (A) and amphiphilic carbosilane dendrimer (B)

8 結(jié) 語(yǔ)

基于siRNA的RNAi療法因其特異的基因沉默效應(yīng)受到廣泛關(guān)注，2018年首款siRNA藥物Onpattro?上市，標(biāo)志著RNAi療法從概念走向臨床實(shí)際應(yīng)用。然而siRNA分子本身不能在體內(nèi)發(fā)揮其基因沉默效應(yīng)，需要載體對(duì)其進(jìn)行保護(hù)和遞送。樹(shù)形分子作為一種高效的非病毒siRNA遞送載體，引起了越來(lái)越多的關(guān)注。它們的優(yōu)勢(shì)在于結(jié)構(gòu)精確可控，具有獨(dú)特的多價(jià)性等等，這些特性使其成為理想的siRNA遞送載體。研究學(xué)者們對(duì)傳統(tǒng)樹(shù)形分子進(jìn)行了一系列的結(jié)構(gòu)改造，以此開(kāi)發(fā)了各種用于siRNA遞送的多功能樹(shù)形分子遞送平臺(tái)，以期待最大限度地提高遞送的有效性和特異性，并將毒性降至最低。在上述各類(lèi)樹(shù)形分子遞送平臺(tái)中，聚丙烯亞胺類(lèi)、碳硅烷類(lèi)、三嗪類(lèi)樹(shù)形分子由于分子本身的毒性或生物相容性不佳等原因使它們?cè)趕iRNA遞送中的應(yīng)用相對(duì)較少；而聚酰胺-胺類(lèi)、肽類(lèi)和聚甘油類(lèi)樹(shù)形分子具有相對(duì)較好的生物相容性，其中聚酰胺-胺類(lèi)樹(shù)形分子的研究最為深入，其siRNA遞送效果也最為理想。這主要是因?yàn)橐环矫嬖谏項(xiàng)l件下PAMAM樹(shù)形分子中帶正電的胺基基團(tuán)可與帶負(fù)電的siRNA通過(guò)靜電相互作用結(jié)合并透過(guò)細(xì)胞膜將其輸送到目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)，另一方面PAMAM樹(shù)形分子內(nèi)部的叔胺基團(tuán)通過(guò)“質(zhì)子海綿”效應(yīng)促進(jìn)siRNA/樹(shù)形分子納米粒的內(nèi)涵體逃逸和siRNA的有效釋放；反觀傳統(tǒng)的肽類(lèi)和聚甘油類(lèi)樹(shù)形分子，因無(wú)法同時(shí)具備結(jié)合siRNA和促進(jìn)其內(nèi)涵體逃逸及siRNA釋放的結(jié)構(gòu)，所以在一定程度上限制了這兩類(lèi)樹(shù)形分子在siRNA遞送中的應(yīng)用。雖然目前樹(shù)形分子進(jìn)行siRNA遞送的研究已經(jīng)取得了一些令人鼓舞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但在推進(jìn)其臨床轉(zhuǎn)化的過(guò)程中仍存在一些亟待解決的問(wèn)題：例如如何實(shí)現(xiàn)符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)要求的樹(shù)形分子的工業(yè)化生產(chǎn)，以及缺乏樹(shù)形分子體內(nèi)代謝過(guò)程和安全性等的認(rèn)知研究等。相信在化學(xué)、生物、物理、醫(yī)學(xué)等各領(lǐng)域?qū)＜业膮f(xié)同合作下，將會(huì)有越來(lái)越多的樹(shù)形分子被開(kāi)發(fā)和研究作為siRNA遞送載體，其在臨床應(yīng)用中也將日益廣泛。