欒保磊，徐新軍，梁桂挺，游孟夢(mèng)，劉國柱

(1中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510006；2東陽光藥物研究院，東莞 523871)

基因毒性雜質(zhì)研究是近年來藥物質(zhì)量研究與控制的熱點(diǎn)與難點(diǎn)，愈加受到各國官方機(jī)構(gòu)重視，并相繼出臺(tái)指導(dǎo)原則[1-4]?；蚨拘噪s質(zhì)在極低濃度時(shí)即可與人體內(nèi)的遺傳分子DNA進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，造成不可逆的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致基因突變，并可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，因此在藥物中被允許的限度非常度低，通常為百萬分之一水平，具體按日劑量及毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC)進(jìn)行計(jì)算。藥物中基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)對(duì)測(cè)定方法的專屬性與靈敏度具有非常高的要求[5-8]。

奧美沙坦酯(olmesartan medoxomil)結(jié)構(gòu)見圖1，是一種前體藥物，口服后在胃腸道中迅速完全水解為活性物質(zhì)奧美沙坦而發(fā)揮降血壓作用。奧美沙坦是選擇性血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1)拮抗劑，通過選擇性阻斷血管緊張素Ⅱ與血管平滑肌AT1受體的結(jié)合而阻斷血管緊張素Ⅱ的收縮血管作用，主要用于高血壓的治療[9-11]。奧美沙坦酯為長期用藥，基于法規(guī)要求需要對(duì)基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行研究與控制。奧美沙坦酯(OLM)的重要起始物料N-(三苯基甲基)-5-(4′-溴甲基聯(lián)苯-2-基)四氮唑(BBTT1)含有約1%～2%的二溴代雜質(zhì)N-(三苯基甲基)-5-(4′-二溴甲基聯(lián)苯-2-基)四氮唑(BBTT2)，反應(yīng)中均會(huì)脫掉三苯甲基保護(hù)基分別生成5-(4′-溴甲基聯(lián)苯-2-基)四氮唑(BBT1)和5-(4′-二溴甲基聯(lián)苯-2-基)四氮唑(BBT2)，兩產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式見圖1，均為潛在基因毒性雜質(zhì)，雜質(zhì)研究中易被忽略，存在著極大的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)。常用于有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的HPLC法不能滿足檢測(cè)靈敏度要求，基因毒性雜質(zhì)的測(cè)定是奧美沙坦酯質(zhì)量控制的難點(diǎn)[12-14]。已有測(cè)定奧美沙坦酯中BBTT1和BBTT2的文獻(xiàn)報(bào)道[15]，但未見奧美沙坦酯中BBT1和BBT2的文獻(xiàn)報(bào)道，迫切需要建立檢測(cè)方法以保證產(chǎn)品質(zhì)量。因此本文擬建立一種LC-MS法同時(shí)測(cè)定奧美沙坦酯中兩種新的基因毒性雜質(zhì)BBT1和BBT2含量的方法。

Figure1 Chemical structures of OLM，BBT1 and BBT2

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Agilent 1200 高效液相色譜儀配DAD紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器及柱溫箱；Agilent 6120單四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器，配有電噴霧電離源(美國安捷倫公司)。

1.2 試 藥

乙腈(色譜純，德國默克公司)；丙酮(色譜純，美國霍尼韋爾公司)；甲酸(分析純，成都科龍化學(xué)試劑有限公司)；超純水(美國密理博超純水儀自制)。奧美沙坦酯(批號(hào)OLM-1411001、OLM-1411002、OLM-1411003)，5-(4′-溴甲基聯(lián)苯-2-基)四氮唑?qū)φ掌?純度95.4%)，5-(4′-二溴甲基聯(lián)苯-2-基)四氮唑?qū)φ掌?純度95.1%)均由東陽光藥物研究院合成。

2 方 法

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱： Agilent Zorbax Eclipse

Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：以0.1%甲酸水溶液為A相，乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫(0～7 min，60% B；7.0～7.5 min，60% B→100% B；7.5～13 min，100% B；13～13.1 min，100% B→60% B；13.1～20 min，60% B)；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；柱后分流比：1∶1。

2.1.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜離子源：ESI電噴霧離子化正離子采集模式(ESI+)；干燥氣體流速：11 L/min；霧化室壓力：310 kPa；干燥氣體溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：3 500 V；選擇離子監(jiān)測(cè)模式(SIM)，0～9 min檢測(cè)離子m/z315和m/z395。

2.2 溶液的制備

以丙酮為空白溶液。分別取BBT1對(duì)照品和BBT2對(duì)照品約23.4 mg，精密稱定，加丙酮溶解并定容至100 mL，搖勻；精密量取上述溶液1 mL，加丙酮稀釋定容至50 mL，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。

精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，加丙酮稀釋定容至25 mL，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

取供試品約50 mg，精密稱定，置5 mL量瓶中，加丙酮溶解并定容，搖勻，即得供試品溶液。平行配制2份。

3 結(jié) 果

3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取空白溶液、對(duì)照品溶液依法測(cè)定?？瞻兹芤哼M(jìn)1針，對(duì)照溶液連續(xù)進(jìn)3針。結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液中BBT1和BBT2的分離度為6.8(大于1.5)；對(duì)照品溶液中BBT1和BBT2峰面積的RSD分別為2.9%和2.7%(小于10%)，說明本法系統(tǒng)適用性良好。

3.2 專屬性考察

取供試品約250 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，加空白溶液溶解并定容，搖勻，作為供試品加標(biāo)溶液。分別取空白溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液和供試品加標(biāo)溶液，依法測(cè)定，記錄色譜圖，見圖2。結(jié)果顯示，BBT1和BBT2分離度良好，空白無干擾，100%供試品加標(biāo)溶液較供試品溶液對(duì)應(yīng)峰面積有增加。本法專屬性良好。

Figure2 HPLC chromatograms of speciality tests and LOD

1：BBT1；2：BBT2

A:Blank solution；B:Standard solution,BBT1 0.37 μg/mL and BBT2 0.36 μg/mL；C:Sample solution,OLM 10 mg/mL and BBT2 0.04 μg/mL；D:Spiked sample solution,OLM 10 mg/mL,BBT1 0.37 μg/mL and BBT2 0.40 μg/mL；E:LOD solution，BBT1 3.12 ng/mL and BBT2 6.08 ng/mL

3.3 線性關(guān)系考察

取對(duì)照儲(chǔ)備液適量，用空白溶液稀釋，分別配制成約0.094，0.188，0.281，0.375和0.563 μg/mL濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。取定量限溶液、系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，各進(jìn)樣2針。以兩次進(jìn)樣BBT1和BBT2面積平均值分別對(duì)其濃度進(jìn)行二元線性回歸。結(jié)果顯示，BBT1的線性方程為：Y=1.349 5×105X+3.623 2×103，r=0.998，線性范圍為0.009 4～0.561 0 μg/mL，BBT2的線性方程為：Y=9.419 5×104X+1.478 3×103，r=0.999，線性范圍為0.018 2～0.547 5 μg/mL。本法線性關(guān)系良好。

3.4 檢測(cè)限與定量限測(cè)定

取對(duì)照品溶液適量，用空白溶液逐級(jí)稀釋成峰高約為基線噪音10倍的溶液，作為定量限溶液；用空白溶液逐級(jí)稀釋成峰高約為基線噪音3倍的溶液，作為檢測(cè)限溶液。取定量限和檢測(cè)限溶液，依次各進(jìn)樣3次。結(jié)果顯示，BBT1和BBT2的定量限分別為9.35 ng/mL(S/N=11，RSD=2.4%)和18.25 ng/mL(S/N=12，RSD=1.1%)，檢測(cè)限分別為3.12 ng/mL(S/N=3.5)和6.08 ng/mL(S/N=4)，見圖2-E，表明本方法靈敏度較高。

3.5 加樣回收試驗(yàn)

分別稱取供試品9份，分別加入適當(dāng)濃度的對(duì)照品儲(chǔ)備液，使得加入質(zhì)量濃度相當(dāng)于0.094 μg/mL、0.375 μg/mL和0.563 μg/mL，每個(gè)濃度水平各配制3份。取供試品溶液、準(zhǔn)確度溶液依次進(jìn)樣。結(jié)果顯示，BBT1和BBT2的平均回收率分別為96.5%和98.0%，總體回收率的RSD(n=9)分別為4.8%和5.1%，本法準(zhǔn)確度良好。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取6份供試品加標(biāo)溶液，含供試品、BBT1和BBT2質(zhì)量濃度依次為10 mg/mL，0.37 μg/mL和0.40 μg/mL，依法測(cè)定，每份溶液各進(jìn)樣1次，計(jì)算每份溶液中BBT1和BBT2的含量。結(jié)果顯示，6份供試品加標(biāo)溶液中BBT1和BBT2含量的RSD為3.4%和2.8%。本法重復(fù)性良好。

3.7 溶液穩(wěn)定性考察

取對(duì)照品溶液、供試品加標(biāo)溶液，分別于制備0，6，12 h后，根據(jù)“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析測(cè)定，記錄BBT1和BBT2的色譜峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液中BBT1和BBT2峰面積的RSD分別為4.7%和5.8%,供試品加標(biāo)溶液中BBT1和BBT2峰面積的RSD分別為1.0%和1.5%，本法對(duì)照品溶液和供試品加標(biāo)溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 樣品測(cè)定

取BBT1對(duì)照品、BBT2對(duì)照品和3批奧美沙坦酯適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，對(duì)照品溶液配制1份，連續(xù)進(jìn)樣3次；供試品溶液每批平行配制2份，各進(jìn)樣1次。用外標(biāo)法計(jì)算供試品中BBT1和BBT2含量，結(jié)果見表1。

奧美沙坦酯最大日劑量為40 mg，根據(jù)基因毒性雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則，烷基化試劑BBT1和BBT2為潛在基因毒性雜質(zhì)，按照TTC 1.5 μg計(jì)算，限度為37.5 μg/g，但由于BBT1和BBT2為同一類型的基因毒性雜質(zhì)，限度分別為18.8 μg/g，以兩物質(zhì)的含量合計(jì)，限度為不大于37.5 μg/g，3批樣品中BBT1和BBT2的含量之和均符合規(guī)定。

Table1 Result of content of BBT1 and BBT2 in 3 batches of olmesartan medoxomil

BatchBBT1/(μg/g)BBT2/(μg/g)OLM-1411001NDNDOLM-1411002ND4OLM-1411003ND3

ND:Not detected

4 討 論

4.1 溶液穩(wěn)定性的考察和溶劑的選擇

方法開發(fā)初期，曾嘗試建立一種同時(shí)檢測(cè)BBTT1、BBTT2、BBT1和BBT2 4種基因毒性雜質(zhì)的方法，考察后發(fā)現(xiàn)，BBT1和BBT2會(huì)誘導(dǎo)BBTT1和BBTT2脫保護(hù)反應(yīng)而造成對(duì)照品溶液不穩(wěn)定，回收率不達(dá)標(biāo)等問題，故選擇分別建立兩種方法檢測(cè)4個(gè)基因毒性雜質(zhì)，本研究建立一種LC-MS法同時(shí)測(cè)定奧美沙坦酯中兩種基因毒性雜質(zhì)BBT1和BBT2含量的方法。為了達(dá)到足夠的靈敏度，奧美沙坦酯的供試品質(zhì)量濃度需要高達(dá)10 mg/mL，試驗(yàn)表明乙腈、甲醇和水中均無法完全溶解，故選擇溶解度較好的丙酮作為溶劑。

4.2 梯度的確定

在方法開發(fā)初期曾嘗試等度洗脫的方法，但在該條件下進(jìn)樣后再進(jìn)對(duì)照溶液BBT1和BBT2的峰面積會(huì)明顯降低。該問題可能原因?yàn)閵W美沙坦酯導(dǎo)致信號(hào)抑制。最終采用梯度洗脫，分析方法驗(yàn)證表明所建立的梯度洗脫方法具有較好的重復(fù)性。

4.3 樣品濃度和質(zhì)譜采集時(shí)間的確定

為了獲得較好的靈敏度，方法選擇的樣品質(zhì)量濃度為10 mg/mL。該濃度下，主成分奧美沙坦酯雖然獲得了較強(qiáng)的保留及對(duì)稱的峰形，但若如此高濃度的奧美沙坦酯進(jìn)質(zhì)譜，會(huì)嚴(yán)重污染質(zhì)譜離子源，導(dǎo)致方法耐用性差。因此，所建立的方法只有前9.5 min進(jìn)行質(zhì)譜分析并記錄質(zhì)譜SIM色譜圖(BBT1在約5.0 min出峰，BBT2在約6.3 min出峰)，9.5 min后通過閥切換至廢液，不進(jìn)質(zhì)譜分析(奧美沙坦酯在約11.4 min出峰)。

4.4 檢測(cè)結(jié)果討論

起始物料BBTT1充分反應(yīng)后含量較小，而不參與反應(yīng)的BBTT2剩余量為1%～2%，經(jīng)歷脫保護(hù)反應(yīng)后，生成BBT2，經(jīng)多步純化去除后，仍有檢出。此結(jié)果充分證明了建立測(cè)定奧美沙坦酯中基因毒性雜質(zhì)BBT1和BBT2含量方法的必要性，本文為奧美沙坦酯中兩種新的潛在基因毒性雜質(zhì)研究提供了檢測(cè)方法。

5 結(jié) 論

本研究所建立的方法專屬性強(qiáng)，線性關(guān)系和重復(fù)性良好，準(zhǔn)確度高，檢測(cè)限低，定量限能滿足分析要求，可以準(zhǔn)確地測(cè)定奧美沙坦酯中基因毒性雜質(zhì)BBT1和BBT2的含量。