黃澤瑋　劉忠瑩　黃瑛　杜鋼　賀亞玲

摘要：建立基于Orbitrap-Elite高分辨質譜的快速篩查及確證減肥及壯陽類保健食品和中成藥中54種非法添加物的方法。采用Hypersil GOLD C18 column色譜柱（150mm×2.1mm，1.9μm），梯度洗脫，流量0.3mL/min，正離子全掃描/數(shù)據(jù)依賴的二級掃描模式，在28min內完成54種目標化合物的分離和高精度一級、二級質譜掃描，并通過Exact Finder 2.0軟件進行快速篩查，以確證樣品中是否摻加減肥及壯陽類化學藥物。結果顯示在28min內54種化合物能得到較好分離;6種基質加標溶液中54種化合物的一級與二級離子精確質量數(shù)的實測值與理論值均在5×10^-6誤差之內;空白溶液中54種化合物結果均為陰性;20批減肥及壯陽類保健食品及中成藥樣品中檢出1批陽性樣品，陽性率5%0該方法操作簡單快捷，結果定性準確，無假陰性和假陽性情況出現(xiàn)，可用于減肥及壯陽類保健食品和中成藥中54種非法添加的高通量快速篩查及確證。

關鍵詞：Orbitrap-Elite高分辨質譜;非法添加;快速篩查;減肥;壯陽

中圖分類號：O657.63 文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2019）01-0070-07

0 引言

近年來，隨著社會經濟的發(fā)展和人們生活水平的提高，人們對保健食品及中成藥的需求與日俱增，其中減肥及壯陽類相關產品尤其受到人們的青睞。然而這一類產品中檢出非法添加的情況時有發(fā)生。近年來許多不法商家為謀取暴利，在該類產品中添加化學成分，為消費者埋下了健康隱患。因此，為嚴厲打擊非法添加行為，保證人民群眾的生命安全，需要開發(fā)快速、準確、高選擇性的方法用于減肥及壯陽類非法添加的檢測。

目前常用的非法添加檢驗方法主要有薄層色譜法[1]、液相色譜法[2-3]和低分辨液質聯(lián)用法[4-5]，其存在選擇性差、干擾多、定性能力弱等缺點。Orbitrap是近20多年來質譜分析器的突破性技術，通過靜電場軌道肼方式提供高質量分辨能力和精確質量數(shù)[6]，可在有限的時間范圍對數(shù)量龐大的化合物進行篩查。其最高分辨率可達24萬以上，質量精度可達10^-7～10^-6。有報道使用Orbitrap高分辨質譜對降糖類中成藥和保健食品中的非法添加化學藥物[7]以及動物肌肉中的β2受體激動劑[8]進行檢測。本文將Orbitrap-Elite高分辨質譜技術用于減肥及壯陽類保健食品及中成藥中54種非法添加物的快速篩查及確證。通過全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描（FullMS/dd-MS²）模式，在28min內完成對樣品的分離和高精度一級、二級掃描，并通過Exact Finder2.0軟件進行快速篩查和確證。本方法具有快速、準確、高選擇性的特點，為打擊日益猖撅的非法添加行為提供了新手段。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Orbitrap-Elite高分辨質譜聯(lián)用儀（Thermo FisherScientific），裝配有HESI-II源：Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜（Thermo Fisher Scientific）。

1.2 對照品

鹽酸苯丙醇胺、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、鹽酸甲基麻黃堿、鹽酸安非他酮、鹽酸芬氟拉明、鹽酸氟西汀、鹽酸西布曲明、辛伐他汀、非諾貝特來源于中國藥品生物制品檢定所;安非他明硫酸鹽、鹽酸甲基安非他明、吲達帕胺、酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、比沙可啶、洛伐他汀、奧利司他、煙酸、茶堿、那紅地那非、紅地那非、氨基他達拉非、西地那非、硫代艾地那非、偽伐地那非、那莫西地那非來源于中國食品藥品檢定研究院;鹽酸氯卡色林、布美他尼、利莫那班鹽酸鹽、鹽酸去甲氟西汀、美伐他汀、洛伐他汀羥酸鈉鹽、西立伐他汀鈉、氟伐他汀鈉、依替米貝、阿伐麥布、鹽酸去甲芬氟拉明、琉基西地那非、去甲基他達拉非來源于Toronto Research Chemicals INC.;芐基西布曲明鹽酸鹽、鹽酸豪莫西布曲明、鹽酸氯代西布曲明、他達拉非、羥基豪莫西地那非、鹽酸伐地那非、硫代豪莫西地那非、烏地那非、二甲基西地那非、羥基硫代豪莫西地那非來源于TLC PharmaChem;去甲偽麻黃堿鹽酸鹽、分特拉明來源于SIGMA-Alorch company;左旋肉堿來源于LGC Gmbh;純度均>94%。1.3試劑及耗材

甲醇、甲酸銨（色譜級）：Fisher Chemical;甲酸（優(yōu)級純）：Anpel;Pierce^TMLTQ Velos ESI PositiveIon Calibration Solution（質譜校正液：含有咖啡因，MRFA，Ultramark 1621，正丁胺）：Thermo FisherScientific;20批保健食品及中成藥樣品：四川省食品藥品檢驗檢測院市場抽樣。

2 方法與結果

2.1 測定方法與數(shù)據(jù)處理

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18 column（150mm×2.1mm，1.9μm），Thermo Fisher Scientific：流量0.3mL/min;流動相為5mmol/L的甲酸銨溶液（A相，含0.1%甲酸）-0.1甲酸甲醇（B相）;梯度洗脫：0min（95：5）→4min（95：5）→10min（60：40）→14min（60：40）→16min（40：60）→17min（5：95）→25min（5：95）→25.1min（95：5）→28min（95：5）;柱溫：35℃;進樣量：2μL。

2.1.2 質譜條件

采用HESI-Ⅱ源（正離子模式），噴霧電壓為3.6kV，毛細管和霧化器溫度均為350℃。鞘氣和輔助氣分別為4.5L/min和6.5L/min，S-lens RF level為60%。霧化氣為氮氣，碰撞氣為氦氣。使用質譜校正液5d校正1次質量軸。掃描方式采用全掃描/數(shù)據(jù)依賴的二級掃描（Full MS/dd-MSZ）模式，此模式包含1次全掃描（分辨率30000）和1次數(shù)據(jù)依賴的二級掃描（分辨率15000）。一級全掃描范圍為100～700m/z，自動增益控制和離子注人時間分別設為1.0×10⁶和100ms;數(shù)據(jù)依賴的二級掃描（dd-MS²）使用動態(tài)排除（Dynamic Exclusion）功能，具體參數(shù)：Repeat count設為2，Repeat duration設為4.0s，Exclusion list size設為500，Exclusion duration設為6.0s：Minimum signal threshold設為1000count;Analyze top N peaks設為10;Activation type設為CID：Isolation window設為2.0m/z;ActivationQ設為0.250;Activation time設為10.00ms;針對每個目標化合物分別設置最佳歸一化碰撞能量，詳見表1。

2.1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Exact Finder 2.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。將54種化合物的保留時間、一級精確質量數(shù)和二級碎片離子精確質量數(shù)錄入軟件，形成數(shù)據(jù)庫，用于定性篩查和確證：在Screening Method中設置目標化合物數(shù)據(jù)庫：以化合物保留時間和一級精確質量數(shù)作為篩查依據(jù)，以二級碎片離子精確質量數(shù)作為確證依據(jù);樣品與對照品的一級及二級離子精確質量數(shù)偏差應≤5×10^-6，峰閾值、S/N信噪比閾值分別設為400和5;保留時間窗設置為15s。

2.2 溶液配制

2.2.1 混合對照品溶液

精密稱取54種化合物的對照品各約10mg，分別置于25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為各對照品儲備液。分別精密吸取各對照品儲備液適量，置于同一100mL量瓶中，用流動相稀釋并定容至刻度，作為混合對照工作液。

2.2.2 供試品溶液

固體制劑（膠囊取內容物）：研磨均勻后，精密稱取1g，置于10mL量瓶中，加甲醇約8mL，超聲30min，放置至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22μm微孔濾膜，即得。液體制劑：精密稱取1g，置于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22μm微孔濾膜，即得。

2.3 結果

空白溶液的總離子流圖如圖1所示，在12.16，14.55min雖有峰出現(xiàn)（其一級質譜圖分別見圖2，圖3），但是其一級質譜對各化合物的檢測無干擾?；旌蠈φ掌饭ぷ饕褐?4種化合物的總離子流圖如圖4所示，分析物峰形良好，54種化合物均能得到較好分離。其中6組同分異構體均能通過保留時間進行區(qū)分。單次測定在28min內可完成54種化合物的篩查，通過Exact Finder進行數(shù)據(jù)處理分析效率高?；衔锉Ａ魰r間、一級與二級離子準確質量數(shù)和最佳歸一化碰撞能量如表1所示。可觀察到對照品溶液中54種化合物的實測與理論質量數(shù)偏差均小于5×10^-6，顯示了Orbitrap-Elite高分辨質譜高度可靠的質量精度。

以甲醇逐級稀釋各混合對照品儲備液，精密吸取2μL進樣。在進樣濃度盡可能低的情況下，以保證連續(xù)三針進樣定性正確（實測一級精確質量數(shù)和二級碎片精確質量數(shù)與理論質量數(shù)的偏差均≤5×10^-6）來確定檢出限;檢出限的結果見表1，54種化合物的檢出限均小于10μg/g;以進樣六針檢出限溶液中各化合物峰面積的RSD表示精密度，精密度RSD（詳見表1）均小于20%。

選擇陰性的保健食品及中成藥（包括片劑、膠囊劑、茶劑、酒、顆粒劑、咖啡）共6種基質，分別稱取樣品1g，精密量取對照品儲備液適量，使供試品溶液最終濃度為各化合物檢出限濃度，與供試品溶液同法制備后進樣測定。經Exact Finder數(shù)據(jù)處理結果顯示，六種基質加標溶液中54種化合物的一級與二級離子精確質量數(shù)的實測值與理論值均在5×10^-6誤差之內，無假陰性情況。同時進行空白試驗，54種化合物結果均為陰性，無假陽性情況。

2.4 方法的應用

將建立的方法用于非法添加檢測工作。所篩查的化合物基本囊括了現(xiàn)有國家標準對壯陽類和減肥類非法添加的化合物種類，另外還增加了部分壯陽或減肥作用的化合物以擴大篩查范圍。樣品按“2.2.2”項方法處理后，進樣2μL，Orbitrap-Elite高分辨質譜檢測，得到數(shù)據(jù)在Exact Finder 2.0軟件進行快速篩查和確證。在20批減肥及壯陽中成藥和保健食品中共檢出1批陽性樣品。陽性率5%，檢出的非法添加物為西布曲明，總離子流圖見圖5，西布曲明一級質譜圖見圖6，西布曲明二級碎片離子圖見圖7。按照BJS201701《食品中西布曲明等化合物的測定》對陽性結果進行驗證，定性結果與本方法一致。

3 討論

3.1 同分異構體

54種目標化合物中存在6組同分異構體。其中三組為光學異構體（苯丙醇胺（5.5min）-去甲偽麻黃堿（6.2min），麻黃堿（7.5min）-偽麻黃堿（7.7min），甲基安非他明（9.0min）-分特拉明（9.4min）），其一級與二級碎片精確質量數(shù)均一致，在定性上需要通過保留時間來區(qū)分，因此在梯度洗脫的設計上，前10min采用較緩的梯度（0min（95：5）→4min（95：5）→10min（60：40））以保證上述光學異構體在色譜行為上做到徹底分離，相互不干擾;另外還存在3組同分異構體（偽伐地那非（18.2min）-那莫西地那非（18.9min），伐地那非（11.6min）-二甲基西地那非（12.5min），硫代艾地那非（16.9min）-硫代豪莫西地那非（17.2min）），在保留時間不同的同時，選擇定性離子時避免選擇相同質量的碎片離子，以保證定性的準確性。

3.2 實驗參數(shù)的優(yōu)化

研究對比了Thermo Hypersil GOLD C18 column（2.1mm×150mm，1.9μm）、Thermo Acclaim RSLCC18（2.1mm×100mm，2.2μm）、Agilent ZORBAXEclipse XDB-C8（2.1mm×50mm，1.8μm）等色譜柱對待測化合物的分離效果。最終選擇Thermo HypersilGOLD C18 column（2.1mm×150mm，1.9μm）色譜柱，其對于中段出峰密集階段（10～16min）也可以做到所有化合物基本分離，且峰形良好。

在Full MS/dd-MS²掃描模式中，當全掃描數(shù)據(jù)中出現(xiàn)與目標化合物一級精確質量數(shù)相匹配的質量數(shù)時觸發(fā)二級掃描，按照各化合物給定的最佳歸一化碰撞能量進行二級碎裂，獲得的二級碎片離子作為確證離子，用于確證化合物的定性。使用FullMS/dd-MS²數(shù)據(jù)掃描可減少非目標信息的采集，提高目標信息的準確度和分辨率。其中還使用了動態(tài)排除功能，其作用是某一信號在4s內被掃描到2次后，將信號放進排除列表，在接下來的6s內若再掃描到該信號不再進行二級碰撞，其意義在于避免響應高化合物的重復掃描，增加掃描的化合物個數(shù)，尤其是響應相對較低的化合物。

通過查閱文獻[9-12]，在非法添加分析中，普遍采用有機試劑+超聲提取的方式前處理。常用的有機溶劑便是甲醇、乙腈和一定比例的甲醇和水，故考察了甲醇、乙腈、50%甲醇的提取效果，結果發(fā)現(xiàn)3種溶劑提取后，各化合物的回收率無顯著差異;通過對陽性樣品的提取比較，結果無明顯差異?？紤]操作方便、成本、環(huán)保和對實驗人員的健康影響（乙腈毒性比甲醇大）等因素，選擇甲醇作為提取溶劑。

3.3 檢出限的確定

從非法添加的角度，一般都會超量添加化學成分，從藥效學角度出發(fā)，太低的添加濃度也不具有藥效學意義;另外若使用3倍信噪比的方式來確定檢出限，本方法檢出限會降低至現(xiàn)有水平的百分之一～千分之一，但是在這樣的檢出限水平下，即使是純對照品溶液，也可能會出現(xiàn)假陰性的情況。因此本實驗中，一方面所確定的檢出限均能滿足各化合物最低起效劑量，另一方面通過在進樣濃度盡可能低的情況下，以保證連續(xù)三針進樣定性正確來確定檢出限。這種方式能有效保證定性結果的準確性，避免出現(xiàn)假陰性。

4 結束語

本文將Orbitrap-Elite高分辨質譜技術用于保健食品及中成藥中的減肥及壯陽類化學藥物的快速篩查和確證。采用Full MS/dd-MS²模式，在28min內完成對樣品中分析物的分離和高精度一級、二級掃描，并以Exact Finder 2.0軟件進行快速篩查和確證。方法操作簡單快捷、結果定性準確，無假陰性和假陽性情況出現(xiàn)。在20批減肥及壯陽類保健食品及中成藥中檢出1批陽性樣品，陽性率為5%。Orbitrap-Elite高分辨質譜具有快速、準確、高選擇性的特點，為打擊日益猖撅的非法添加行為提供了新工具、新技術。

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