王蒙 楊柳易 楊婧 王琛

摘要：目的 ?觀察腎衰Ⅱ號方對5/6（ablation /infarction，A/I）腎切除慢性腎衰竭（CRF）大鼠殘余腎組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法 ?SD雄性大鼠采用5/6（A/I）腎切除術(shù)制備CRF大鼠模型，隨機分為模型組、腎衰Ⅱ號方組、西藥組，每組15只，另取15只大鼠作為假手術(shù)組。各組給予相應(yīng)干預(yù)，60 d后Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax、Cleaved-parp的表達(dá)，免疫組化檢測p53、Bax蛋白的表達(dá)，透射電鏡觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 ?與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)p53、Bax、Cleaved-parp蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組大鼠腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)p53、Bax、Cleaved-parp蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，p53、Bax蛋白表達(dá)主要位于腎小管，模型組大鼠炎性細(xì)胞浸潤明顯，蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高，各給藥組較模型組炎性細(xì)胞浸潤減輕，p53和Bax蛋白表達(dá)降低。透射電鏡結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)未見細(xì)胞凋亡，超微結(jié)構(gòu)正常，模型組大鼠核固縮，細(xì)胞凋亡出現(xiàn)，超微結(jié)構(gòu)紊亂，各給藥組較模型組超微結(jié)構(gòu)改善，少見細(xì)胞凋亡發(fā)生。結(jié)論 ?腎衰Ⅱ號方可抑制5/6（A/I）腎切除CRF大鼠細(xì)胞凋亡，其作用機制可能與下調(diào)p53、Bax、Cleaved-parp蛋白表達(dá)相關(guān)。

關(guān)鍵詞：腎衰Ⅱ號方;慢性腎衰竭;腎間質(zhì)纖維化;腎功能;凋亡;大鼠

中圖分類號：R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）05-0064-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.014 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Objective To observe the effects of Shenshuai Ⅱ Prescription （SSP） on the apoptosis-related protein expressions in the chronic renal failure （CRF） rats induced by 5/6 （ablation/infarction， A/I） nephrectomy. Methods SD male rats were induced CRF rat model by 5/6 （A/I） nephrectomy and were randomized into model group， SSP group and Western medicine group， with 15 rats in each group. Another 15 rats were recruited as sham-operation group. After 60 days of intervention， the apoptosis-related protein expressions of p53， Bax and Cleaved-parp were tested by Western blot， the protein expressions of p53 and Bax were tested by immunohistochemistry and renal tissue ultrastructure was observed by transmission electron microscope. Results Compared with sham-operation group， the expressions of p53， Bax， and Cleaved-parp in the renal cortex and the medulla increased significantly in model group （P<0.05）. Compared with the model group， the protein expressions of p53， Bax and Cleaved-parp in renal cortex and renal medulla significantly decreased （P<0.05）. The results of immunohistochemistry showed that the protein expressions of p53 and Bax were mainly located in renal tubules. The inflammatory cell infiltration was obvious in the model group， and the protein expressions were significantly higher than those in the sham-operation group. The inflammatory cell infiltration was reduced in the medicine-administered groups compared with the model group， and the protein expressions of p53 and Bax decreased. Transmission electron microscopy showed that there was no apoptosis in the renal cortex and renal medulla of the sham-operation group， the ultrastructure was normal， the model group was pyknosis， apoptosis occurred， and the ultrastructural disorder was disordered. The ultrastructure of each medicine-administered group was improved compared with the model group， and apoptosis was rare. Conclusions SSP can inhibit apoptosis in CRF rats induced by 5/6 （A/I） nephrectomy， which can be associated with down-regulation of protein expressions of p53， Bax， and Cleaved-parp.

Keywords： Shenshuai Ⅱ Prescription; chronic renal failure; renal interstitial fibrosis; renal function; apoptosis; rats

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease， CKD）已經(jīng)成為繼心腦血管疾病、糖尿病，惡性腫瘤之后又一嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。在低、中等收入國家，CKD患者的死亡率已達(dá)14.3%[1]。腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是各種慢性腎臟病進(jìn)展至終末期腎衰竭的共同通路和主要病理基礎(chǔ)。隨著對RIF病理機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在其形成和進(jìn)展中扮演著重要的促進(jìn)作用。Xu等[2]發(fā)現(xiàn)，凋亡相關(guān)斑點樣蛋白中通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑激活凋亡，促進(jìn)RIF。Zhou等[3]報道，TAK1通過調(diào)節(jié)p38誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡促進(jìn)了RIF的進(jìn)展。因此，抑制凋亡可能是延緩RIF進(jìn)展的有效策略。

腎衰Ⅱ號方是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院治療慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）的經(jīng)驗方。研究表明，腎衰Ⅱ號方能通過增加腎血流和改善氧耗，下調(diào)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）和上調(diào)神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）蛋白的表達(dá)，保護(hù)腎功能，延緩RIF的進(jìn)展[4-5]。本課題前期研究表明，腎衰Ⅱ號方能降低5/6腎切除CRF大鼠血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、血尿酸（UA）水平，升高內(nèi)生肌酐清除率（CCr）[6]，但腎衰Ⅱ號方是否對凋亡相關(guān)蛋白有調(diào)控作用尚不清楚。因此，本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，觀察腎衰Ⅱ號方對5/6（ablation/infarction，A/I）腎切除大鼠殘余腎組織凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax、Cleaved-parp的影響，進(jìn)一步揭示本方延緩RIF機制。

1 ?材料與方法

1.1 ?動物

8周齡健康雄性SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量190～210 g，購于西普爾-必凱（上海）實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（滬）2008-0016。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，溫度（22±2）℃，12 h光照，相對濕度（55±2）%。飼料為市售固體普通飼料，飲用水為自來水，自由攝食飲水。

1.2 ?藥物

腎衰Ⅱ號方（黨參15 g，淫羊藿15 g，丹參15 g，當(dāng)歸15 g，制大黃15 g，黃連6 g，紫蘇葉15 g，川芎15 g，桃仁15 g，蟲草菌絲5 g），飲片購于上海康橋中藥飲片公司。全方按臨床常用劑量等比例配制，各藥按一定比例配方后由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院制劑科制備成濃煎藥液（6.09 g原藥材/mL）;氯沙坦鉀片，杭州默沙東制藥有限公司，批號20170414，蒸餾水制備混懸液（5.5 mg/mL）。

1.3 ?主要試劑及儀器

p53單克隆抗體（批號2524T）、Cleaved-parp單克隆抗體（批號9532S），美國Cell Signaling Technology公司;Bax單克隆抗體，英國Abcam公司，批號ab32503;Gapdh抗體，美國Proteintech公司，批號60004-1-Ig;HRP標(biāo)記山羊抗兔或抗小鼠IgG（H+L），碧云天生物科技公司，批號A0208、A0216;電泳及轉(zhuǎn)膜裝置，美國BIO-RAD公司。

1.4 ?造模及分組

隨機選取65只大鼠制備5/6腎切除CRF大鼠模型[7]。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉，固定于恒溫手術(shù)臺上，局部剃毛常規(guī)消毒，于左肋弓下0.5 cm、脊柱向左旁開1 cm處切開一垂直于脊柱長約1.5 cm切口。在無菌條件下經(jīng)后腹膜選取左腎并暴露腎臟，將腎包膜分離后，把左腎動脈的2/3分支結(jié)扎（單個結(jié)扎后支及前降支），縫合，1周后摘除右腎。剔除造模失敗和死亡大鼠后，造模成功存活45只，造模成功率為69%。將45只成模大鼠分為9籠，編號1～9，每籠5只，編號1～5。分別測量每只大鼠體質(zhì)量，利用SPSS19.0軟件建立數(shù)據(jù)庫，錄入籠號和編號，并以體質(zhì)量作為變量，通過設(shè)定隨機種子、產(chǎn)生隨機數(shù)、對隨機數(shù)編秩、對隨機數(shù)秩次排列、隨機確定等步驟確定1～15為模型組，16～30為腎衰Ⅱ號方組，31～45為陽性藥組，每組15只。另取15只大鼠作為假手術(shù)組。

1.5 ?干預(yù)

按60 kg成人標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量常規(guī)用量的20倍給藥，陽性藥組予氯沙坦鉀混懸液（5.5 mg/mL）灌胃，腎衰Ⅱ號方組予腎衰Ⅱ號方濃煎藥液灌胃，藥物灌胃劑量參照本課題組既往研究用量[5]，給藥體積2 mL。假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水2 mL灌胃。每日1次，連續(xù)60 d。干預(yù)期間自由攝食飲水。

1.6 ?檢測指標(biāo)

1.6.1 ?樣本采集與處理

2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）大鼠腹腔注射麻醉，打開腹腔，下腔靜脈采血，4 ℃、4000 r/min離心10 min，收集血清。摘取左腎，將左腎橫切為二，一半取5塊1 mm×1 mm×1 mm組織置于電鏡固定液，剩余組織置于10%中性緩沖福爾馬林液，固定24 h，石蠟包埋，切片（厚約3 μm），行免疫組化檢測;一半沿皮髓交界線切開分離皮髓部，分裝后放入液氮，置于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot檢測。

1.6.2 ?Western blot檢測

每組隨機選取6個樣本，每20 mg組織加0.2 mL lysis buffer （RIPA∶PMSF=100∶1），每個2.0 mL EP管中加入1個直徑5 mm鋼珠，置于勻漿機充分裂解， 4 ℃、13 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)至1.5 mL EP管，4 ℃、13 000 r/min離心5 min，BCA法測定蛋白濃度，制備蛋白樣品，100 ℃、5 min煮沸變性，置于-20 ℃冰箱保存。按30 μg/孔蛋白上樣量，8%SDS-聚西烯酰胺凝膠電泳，120 V電泳，濕轉(zhuǎn)法以100 V、120 min轉(zhuǎn)膜，與5%脫脂奶粉室溫封閉20 min，p53抗體（1∶1000）、Bax抗體（1∶1000）、Cleaved-parp抗體（1∶1000）、GAPDH抗體（1∶2000）與4 ℃搖床100 r/min過夜，HRP標(biāo)記山羊抗兔或HRP標(biāo)記山羊抗小鼠1∶1000室溫100 r/min離心，孵育2 h，0.01%PBS-T清洗10 min/次，3次，ECL發(fā)光，暗室曝光。條帶吸光度值以GAPDH作為內(nèi)參照。

1.7 ?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以±s表示，多樣本均數(shù)兩兩比較采用方差分析，多重比較若方差齊則用LSD法，方差不齊者經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換，使方差齊后再用LSD多重比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 ?一般狀況

干預(yù)60 d后，各組均有15只大鼠存活。假手術(shù)組大鼠反應(yīng)靈敏，皮毛光澤，精力旺盛，一般狀態(tài)良好;模型組大鼠精神萎靡不振，皮毛無光，活動、進(jìn)食減少，體質(zhì)量增加緩慢;腎衰Ⅱ號方組、陽性藥組大鼠精神較前明顯改善，食欲旺盛，活動量增多，體質(zhì)量增加明顯，腎衰Ⅱ號方組整體改善最為明顯。

2.2 ?腎衰Ⅱ號方對模型大鼠殘余腎組織凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax、Cleaved-parp表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)p53、Bax、Cleaved-parp蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組大鼠腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)p53、Bax、Cleaved-parp蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）。結(jié)果見圖1、圖2。

2.3 ?免疫組化染色結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織p53、Bax高表達(dá)，主要位于腎小管，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤明顯;各給藥組較模型組大鼠腎組織炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕，p53和Bax表達(dá)明顯減少。結(jié)果見圖3、圖4。

2.4 ?透射電鏡觀察結(jié)果

假手術(shù)組大鼠腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)交界處近端小管上皮細(xì)胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)和線粒體嵴正常，腎小管、腎小球無明顯病理改變;模型組核固縮，細(xì)胞凋亡出現(xiàn)，線粒體數(shù)量減少，細(xì)胞基質(zhì)顆粒密度減少;陽性藥組線粒體數(shù)量正常，少見細(xì)胞凋亡發(fā)生，未見線粒體嵴斷裂紊亂;腎衰Ⅱ號方組線粒體數(shù)量正常，少見細(xì)胞凋亡發(fā)生，未見線粒體嵴斷裂紊亂。結(jié)果見圖5。

3 ?討論

RIF是各種病因?qū)е碌穆?、進(jìn)展性腎臟疾病的最終歸宿，在各種慢性腎臟疾病的轉(zhuǎn)歸中起著主導(dǎo)作用。對RIF進(jìn)展機制的研究是當(dāng)今腎臟病領(lǐng)域研究的熱點之一。研究表明，中藥在抑制細(xì)胞凋亡、改善腎臟病理損害及延緩RIF方面有著獨特優(yōu)勢。朱敏杰等[8]報道，葛根素能抑制腎臟缺血再灌注大鼠的細(xì)胞凋亡，改善腎功能;吳堅等[9]報道，健脾養(yǎng)正消癥方能通過PI3K/AKT信號通路減少細(xì)胞凋亡，抑制順鉑導(dǎo)致的腎毒性。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，以凋亡為切入點，研究5/6（A/I）腎切除CRF大鼠殘余腎組織凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax和Cleaved-parp的表達(dá)及腎衰Ⅱ號方的干預(yù)作用。

腎衰Ⅱ號方突出了“扶正降濁”治療CRF的思想，方中以黨參、淫羊藿健脾溫腎，溫而不燥，取“少火生氣”之意，共為君藥;臣以蟲草菌絲補命門之火，當(dāng)歸、丹參養(yǎng)血活血，化瘀而不傷正，佐制大黃、黃連、紫蘇葉清熱泄?jié)峤舛?桃仁、川芎增強活血化瘀之力。全方寒溫并用，攻補兼施，契合CRF病機。臨床研究表明，腎衰Ⅱ號方能改善CKD患者的炎癥狀態(tài)，降低炎癥因子的表達(dá)，改善患者的精神狀態(tài)，保護(hù)腎功能[10-11]。

細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控下的細(xì)胞程序性死亡過程，涉及一系列基因的激活和蛋白的表達(dá)[12]。生理狀態(tài)下，細(xì)胞凋亡有利于清除異常細(xì)胞，維持組織器官功能的穩(wěn)定，但過度凋亡會減退正常的生理功能，加重疾病進(jìn)展。研究表明，p53的激活與腎纖維化的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。Wang等[13]報道，在糖尿病腎病模型中，p53的敲除或抑制可改善腎功能，減輕RIF。Rehman等[14]報道，在腎毒性模型中，Diosmin通過下調(diào)p53和Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，減輕腎損傷。p53可通過促進(jìn)凋亡蛋白的活化參與線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，p53能夠與促凋亡蛋白Bax相互作用引起后者轉(zhuǎn)位到線粒體，激活凋亡信號通路[15]。Cheng等[16]報道了氧化低密度脂蛋白能夠上調(diào)p53而激活Bax，引起細(xì)胞色素C的釋放和Caspase活化，誘導(dǎo)凋亡。Mei等[17]報道了腎近端小管細(xì)胞Bax的敲除能抑制凋亡和減輕RIF。因此，Bax對于凋亡因子的釋放和激活起著重要的作用。PARP是DNA損傷的感受器，也是細(xì)胞凋亡時Caspase的切割底物，因此，PARP的活化是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性事件[18]。本研究顯示，與假手術(shù)組比較，5/6（A/I）腎切除大鼠腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)殘余腎組織凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax和Cleaved-parp表達(dá)升高，炎性細(xì)胞浸潤明顯，透射電鏡結(jié)果表明，模型組細(xì)胞凋亡發(fā)生，線粒體數(shù)量減少，超微結(jié)構(gòu)紊亂，說明在CRF大鼠模型中，凋亡被激活。腎衰Ⅱ號方能顯著下調(diào)CRF大鼠殘余腎組織p53、Bax和Cleaved-parp蛋白的表達(dá)，減少炎性細(xì)胞浸潤，超微結(jié)構(gòu)改善明顯，說明腎衰Ⅱ號方可能通過抑制凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax和Cleaved-parp的表達(dá)，起到了保護(hù)腎功能、延緩RIF進(jìn)展的作用。

根據(jù)Brenner的理論，腎臟疾病主要起源于腎小球血流動力學(xué)的改變，但相關(guān)實驗研究表明，小管間質(zhì)的損害與腎功能的進(jìn)展關(guān)系更加密切[19-21]。因此，腎小管間質(zhì)功能的損傷可能是CRF進(jìn)展的共同通路。本研究運用免疫組化檢測分析p53和Bax蛋白的表達(dá)位置，結(jié)果顯示p53和Bax蛋白的表達(dá)主要位于腎小管，由此認(rèn)為腎衰Ⅱ號方可能通過改善腎內(nèi)缺氧下調(diào)了p53、Bax的表達(dá)，但其具體機制需要進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2019-01-01）

（修回日期：2019-01-12;編輯：華強）