吳瑞祥 張國(guó)峰 喬志星 陳瑞云?

1)(山西師范大學(xué)物理與信息工程學(xué)院,臨汾 041004)

2)(原子分子和材料光譜測(cè)量與分析山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西師范大學(xué),臨汾 041004)

3)(山西大學(xué)激光光譜研究所,量子光學(xué)與光量子器件國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太原 030006)

4)(山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院影像科,太原 030001)

1 引 言

單分子光學(xué)探測(cè)消除了系綜平均效應(yīng),已廣泛應(yīng)用于物理、化學(xué)、生物、材料等領(lǐng)域[1-3].單分子的偶極取向[4-6]作為單分子的重要物理參數(shù)之一,決定著單分子熒光輻射的偏振特性及空間分布,從而影響單分子的熒光收集效率[7]及基于單分子熒光成像的分辨率[8].生物體系中蛋白質(zhì)的折疊、肌動(dòng)蛋白的運(yùn)動(dòng)涉及到生物大分子的構(gòu)象變化,可以通過(guò)跟蹤標(biāo)記的熒光分子的取向變化獲得其動(dòng)力學(xué)過(guò)程[9].分子與分子間偶極-偶極相互作用引起的共振能量轉(zhuǎn)移過(guò)程也極大地依賴(lài)于兩個(gè)單分子相對(duì)的偶極取向[10].另外,利用單分子作為載體產(chǎn)生單光子是制備單光子源的有效手段之一[11],基于單光子源的偏振編碼是量子密鑰分發(fā)的重要方案[12].單分子的熒光偏振狀態(tài)取決于其偶極取向,因此單分子偶極取向的有效操控可為基于單分子的單光子源在量子密鑰分發(fā)中的應(yīng)用提供基礎(chǔ).人們已經(jīng)利用寬場(chǎng)散焦成像[13]和掃描共聚焦成像[14]實(shí)現(xiàn)了單分子偶極取向的有效測(cè)量,但是對(duì)單分子偶極取向的確定性操控至今仍然是一個(gè)難題.

Huang等[15]在低溫下通過(guò)脈沖掃描隧道顯微鏡的金屬尖針,將金屬針尖放置在氯鋁酞菁單分子上方并施加正向偏壓脈沖,將單分子面內(nèi)朝上的氯原子轉(zhuǎn)變成面內(nèi)朝下,改變了單分子的偶極取向,從而實(shí)現(xiàn)了單分子二進(jìn)制位的讀寫(xiě)操作.Sandoghdar課題組[16]通過(guò)選取合適的主客體組合,發(fā)現(xiàn)處于對(duì)-三聯(lián)苯晶體中的terrylene單分子的偶極取向被固定在特定方向,其熒光偏振方向垂直于玻璃基底,隨后獲得了高達(dá)96%的單分子熒光收集效率[17].盡管如此,該方法所獲得的分子取向依賴(lài)于特定分子與晶體的組合,不便于推廣應(yīng)用于其他分子.近年來(lái),利用電場(chǎng)實(shí)現(xiàn)單分子操控成為人們的研究熱點(diǎn).Shaik課題組[18,19]用外部定向電場(chǎng)對(duì)分子偶極進(jìn)行選擇從而實(shí)現(xiàn)了分子的手性識(shí)別;Sajadi等[20]利用強(qiáng)太赫茲電場(chǎng)脈沖耦合到分子偶極矩,共振激發(fā)極性液體分子使其重新定向振動(dòng);Kato等[21]研究了電場(chǎng)下單分子的超滯后電極化效應(yīng).

本文利用外部電場(chǎng)作用于摻雜在聚甲基丙烯酸甲酯薄膜中的極性單分子,在溶劑揮發(fā)過(guò)程中對(duì)極性單分子的偶極取向?qū)崿F(xiàn)了有效操控.通過(guò)測(cè)量單分子的熒光偏振方向,研究了外電場(chǎng)對(duì)極性單分子偶極取向的極化特性的影響.

2 實(shí) 驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)中所用的分子1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′,-tetramethylindodicarbocya-nine (DiD,molecular probes)是極性染料分子,分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1(a),圖中紅色箭頭顯示了DiD分子的固有偶極取向.DiD分子的固有偶極矩高達(dá)14.9 D (1 D=3.33564×10—30C·m),其極易于被電場(chǎng)操控.DiD分子的吸收峰位于640 nm,熒光發(fā)射峰位于660 nm.將DiD分子溶解到氯仿溶劑中,稀釋至～10—9mol/L;10 mg的聚甲基丙烯酸甲酯(poly-(methyl methacrylate),PMMA,分子量15000,Sigma-Aldrich)溶解到1 mL的氯仿和二甲基亞砜溶液(Dimethylsulfoxide,DMSO)混合液(1 ：1混合)中;單分子溶液與溶解有PMMA的氯仿/DMSO溶液混合,制備單分子濃度約為10—10mol/L的混合液;將混合液以300 r/min的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)涂覆于玻璃基片上.由于DMSO為難揮發(fā)溶劑,旋轉(zhuǎn)涂覆后單分子樣品溶劑并不會(huì)完全揮發(fā).將旋涂有DiD分子的玻璃基片放置于圖1(b)所示的裝置中,分別施加與單分子樣品表面垂直或平行的勻強(qiáng)電場(chǎng)(場(chǎng)強(qiáng)3500 V/mm),測(cè)量電場(chǎng)作用下單分子熒光偏振響應(yīng)特性.電場(chǎng)作用過(guò)程在真空(＜ 20 kPa)干燥箱中進(jìn)行,作用時(shí)間設(shè)定為90 min,長(zhǎng)于溶劑揮發(fā)所需要的時(shí)間(約60 min).實(shí)驗(yàn)中,選用氯仿和DMSO混合液作為溶劑,減緩溶劑揮發(fā)速度,保證在樣品制備過(guò)程中電場(chǎng)對(duì)單分子的有效操控.溶劑完全揮發(fā)后,單分子被固定于PMMA薄膜中.

圖1 (a)DiD分子的結(jié)構(gòu)式,紅色箭頭表示其固有偶極取向;(b)垂直于單分子樣品表面電場(chǎng)和平行于樣品表面電場(chǎng)操控單分子示意圖Fig.1.(a)Structure of DiD dye molecule with its dipole orientation indicated by a red arrow;(b)schematic of single-molecule sample manipulated by applying a perpendicular or parallel electric field to the surface of single-molecule sample,respectively.

外電場(chǎng)操控后的DiD單分子樣品通過(guò)共聚焦熒光成像系統(tǒng)[22,23]進(jìn)行測(cè)量.利用波長(zhǎng)為635 nm的皮秒脈沖半導(dǎo)體激光器(PicoQuant,PDL808)作為光源激發(fā)單分子樣品.激光經(jīng)過(guò)λ/4和λ/2波片調(diào)整成為圓偏振光,經(jīng)過(guò)擴(kuò)束鏡后被二向色鏡(Semrock,Di01-R635-25×36)反射,被油浸顯微鏡物鏡(Nikon,100×,NA=1.3)聚焦到樣品表面,物鏡聚焦光斑的大小約為350 nm.樣品放置在一個(gè)三維納米位移平臺(tái)(Piezosystemjena,Tritor 200/20 SG)上,通過(guò)移動(dòng)三維納米位移臺(tái)實(shí)現(xiàn)樣品的掃描和熒光成像.單分子發(fā)出的熒光被同一個(gè)物鏡收集,經(jīng)二向色鏡、發(fā)射濾波片(Semrock,FF01-642/LP-25-D)及陷波濾波片(Semrock,NF03-633E-25)濾光后,聚焦到直徑為100 μm的針孔進(jìn)行空間濾波.隨后熒光信號(hào)經(jīng)偏振分束棱鏡(PBS)分成兩束,其中垂直(P)偏振的熒光透過(guò)PBS,而水平(S)偏振的熒光被PBS反射,分別進(jìn)入兩個(gè)單光子探測(cè)器(PerkinElmer,SPCMAQR-15)進(jìn)行熒光探測(cè).

3 結(jié)果與討論

在共聚焦熒光成像系統(tǒng)上通過(guò)逐點(diǎn)掃描的方式對(duì)單分子樣品進(jìn)行熒光成像,實(shí)驗(yàn)中每個(gè)像素點(diǎn)的采樣時(shí)間是10 ms.圖2(a)顯示了摻雜在PMMA聚合物薄膜中未通過(guò)電場(chǎng)作用時(shí)DiD分子在18μm×18μm (100像素×100像素)區(qū)域里的分布,每個(gè)亮點(diǎn)來(lái)自不同DiD分子的熒光.由于單分子所處的納米局部環(huán)境及單分子偶極取向的差異,使得每個(gè)單分子的熒光強(qiáng)度略有不同.為了獲取單分子熒光偏振方向的信息,在得到分子熒光成像后,通過(guò)三維納米位移平臺(tái)將單個(gè)DiD分子移動(dòng)到激光聚焦區(qū)域,測(cè)量單個(gè)分子在S偏振和P偏振方向上熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化.

單分子的躍遷偶極矩如圖2(b)中箭頭所示,與z軸(激光的傳播方向)的夾角為θ,偶極矩在x-y平面(探測(cè)平面)的投影分量與x方向的夾角為α.在二維偏振探測(cè)中,α能夠反映單分子熒光的偏振方向,可以通過(guò)以下公式[24]計(jì)算獲得：

其中,r(t)表示熒光的偏振度,IS和IP分別是單光子探測(cè)器測(cè)量到的S偏振和P偏振方向上單分子熒光的強(qiáng)度.

圖2 DiD單分子的偶極取向與偏振測(cè)量 (a)在18 μm×18 μm區(qū)域內(nèi)DiD單分子的熒光成像;(b)任意偶極取向的DiD單分子的S偏振及P偏振方向熒光探測(cè)示意圖,其中Obj是物鏡,PBS是偏振分束棱鏡;(c)成像圖(a)中紅色圓圈標(biāo)記的DiD分子的S和P偏振方向的熒光強(qiáng)度軌跡圖;(d)熒光偏振方向α隨時(shí)間的變化;(e)DiD分子光漂白前熒光偏振方向的統(tǒng)計(jì),最可幾值為48.8°Fig.2.Fluorescence measurement of single DiD molecules：(a)Fluorescence image of single DiD molecules in 18 μm×18 μm area;(b)schematic view of the S-polarized and P-polarized fluorescence of arbitrary dipole moment for single-molecule (Obj,objective;PBS,polarized beam splitter);(c)fluorescence trajectories of single DiD molecule indicated by the red circle in panel (a)in S and P polarization;(d)the relationship between fluorescence polarization and time;(e)the statistics of fluorescence polarization with the most probable value being 48.8°.

圖2(c)顯示的是熒光成像圖中紅色圓圈標(biāo)記單分子的熒光軌跡,其中單分子熒光在S偏振方向的分量用紅色表示,在P偏振方向的分量用藍(lán)色表示.可以發(fā)現(xiàn)這個(gè)單分子在2.98 s時(shí)發(fā)生了明顯的熒光閃爍現(xiàn)象,在10.13 s時(shí)發(fā)生單步熒光漂白,這兩種現(xiàn)象都是單分子所具有的本質(zhì)特性,表明所觀(guān)測(cè)的這個(gè)分子是單個(gè)分子.摻雜在PMMA中的大部分DiD分子輻射的熒光相對(duì)比較穩(wěn)定,呈現(xiàn)較少的熒光閃爍.利用(1)式可獲得單個(gè)DiD分子的熒光偏振方向α,其隨時(shí)間的變化如圖2(d)所示,可以看出單分子在光漂白之前維持在一個(gè)比較穩(wěn)定的取向.單分子被光漂白后,偏振方向α起伏很大,這是因?yàn)樾盘?hào)并不是來(lái)源于單分子,而是來(lái)自樣品的背景噪聲及單光子探測(cè)器的暗計(jì)數(shù),與單分子的偶極取向無(wú)關(guān).在2.98 s時(shí)偏振方向有一個(gè)較大的突變也是因?yàn)橥瑯拥脑?統(tǒng)計(jì)這個(gè)DiD單分子的熒光偏振方向分布,得到圖2(e)所示的柱狀圖.利用高斯函數(shù)擬合,得到熒光偏振方向α的最可幾值為48.8°,直接反映了這個(gè)單分子的躍遷偶極取向.

實(shí)驗(yàn)測(cè)量了三種不同情況下DiD單分子的熒光偏振方向α的分布：未加電場(chǎng)、垂直電場(chǎng)作用和平行電場(chǎng)作用,圖3為統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果.對(duì)于82個(gè)摻雜在PMMA中未通過(guò)外電場(chǎng)操控的DiD分子,偏振方向α服從單峰擬合的高斯分布,其最可幾值為41.0°,半高全寬為21.9°,如圖3(a)所示.圖3(b)顯示的是78個(gè)摻雜在PMMA中利用3500 V/mm的垂直電場(chǎng)操控后DiD單分子熒光偏振方向α的分布,依然服從單峰擬合的高斯分布,與未加電場(chǎng)時(shí)結(jié)果相比沒(méi)有明顯差別.當(dāng)3500 V/mm的平行方向的勻強(qiáng)電場(chǎng)對(duì)DiD單分子作用后,84個(gè)摻雜在PMMA中的DiD分子熒光偏振方向分布如圖3(c)所示.從圖3(c)可以看到偏振方向的分布與前面兩種情況的分布明顯不同.這些DiD單分子熒光偏振方向α的分布呈現(xiàn)兩個(gè)峰,用雙峰高斯函數(shù)擬合,峰值位置分別對(duì)應(yīng)32.0°和55.5°.研究結(jié)果表明,利用平行電場(chǎng)作用于極性DiD單分子,改變了單分子熒光偏振方向的分布,我們認(rèn)為平行電場(chǎng)作用實(shí)現(xiàn)了單分子取向極化,也就是單分子偶極矩傾向于電場(chǎng)方向排列的現(xiàn)象.

當(dāng)用一個(gè)高數(shù)值孔徑的物鏡收集單分子熒光時(shí),其熒光偏振度r(t)應(yīng)該準(zhǔn)確地表示成[24]：

式中,θ和α與圖2(a)一致;A,B,C是由高數(shù)值孔徑物鏡引入的與角度無(wú)關(guān)的常數(shù),可能引起所測(cè)量偏振方向的并不是均勻隨機(jī)分布[25].對(duì)未經(jīng)取向極化的DiD單分子而言,其熒光偏振方向α分布呈現(xiàn)出以41°為中心的高斯分布.

外電場(chǎng)作用于單分子引起其能量的變化[26]可以簡(jiǎn)寫(xiě)為

圖3 DiD單分子在不同情況下取向極化的效果 (a)未加電場(chǎng);3500 V/mm的(b)垂直電場(chǎng)取向極化和(c)平行電場(chǎng)取向極化;熒光的偏振方向α的統(tǒng)計(jì)峰值分別是(a)41.0° ± 21.9°,(b)44.2° ± 26.3°,(c)32.0° ± 13.5°和55.5° ± 21.6°Fig.3.Polarized orientation for single DiD molecules under the different conditions：(a)Non-electric field;(b)perpendicular and (c)parallel electric field of 3500 V/mm.The peaks ofαare (a)41.0° ± 21.9°,(b)44.2° ± 26.3°,(c)32.0° ±13.5° and 55.5°±21.6°,respectively.

其中δ是單分子的偶極取向與外電場(chǎng)方向的夾角.在外電場(chǎng)的作用下,單分子的偶極取向會(huì)逐漸偏向于電場(chǎng)的方向(δ→ 0),這就是對(duì)單分子產(chǎn)生取向極化的過(guò)程.電場(chǎng)強(qiáng)度越大,δ越小,單分子偶極取向極化的偏轉(zhuǎn)角度Δδ與電場(chǎng)強(qiáng)度有關(guān)[27].

電場(chǎng)方向與單分子的偶極取向之間存在三種情況,如圖4所示,其中紅色箭頭是分子的偶極取向.第一種情況如圖4(a)：外電場(chǎng)與分子偶極取向平行(δ=0或180°),電場(chǎng)并不會(huì)改變分子的偶極取向.第二種情況如圖4(b)：外電場(chǎng)方向與偶極取向垂直(δ=90°),兩個(gè)偶極取向的分子等量地向電場(chǎng)方向偏轉(zhuǎn),如圖中藍(lán)色箭頭所示,此時(shí)分子偶極取向的變化Δδ是一致的.圖4(a)和圖4(b)中極少部分特殊偶極取向的分子并不會(huì)引起偏振方向α的雙峰分布.除了上述兩種特殊情況外,絕大部分隨機(jī)分布的分子偶極取向與電場(chǎng)方向夾角如圖4(c)：在與電場(chǎng)方向夾角δ較小的單分子被完全取向極化前,兩個(gè)分子還是等量地趨向電場(chǎng)方向.由于夾角δ較小的單分子更容易偏轉(zhuǎn)到電場(chǎng)方向,而夾角δ較大的單分子要想與電場(chǎng)方向一致還需要更強(qiáng)的電場(chǎng),在這種情況下,兩個(gè)分子的偶極取向極化過(guò)程不同,存在兩個(gè)夾角δ,導(dǎo)致如圖3(c)中平行電場(chǎng)作用下單分子偶極取向的雙峰分布現(xiàn)象.當(dāng)垂直于x-y平面電場(chǎng)作用于單分子時(shí),電場(chǎng)主要改變的是分子偶極矩的θ角,不會(huì)影響單分子偶極取向在x-y平面的投影角度,也就是與光軸垂直平面的單分子的熒光偏振取向α分布,所以垂直于單分子樣品平面電場(chǎng)作用下單分子偶極取向分布基本不變.當(dāng)平行電場(chǎng)作用于單分子時(shí),引起分子的熒光偏振方向的雙峰分布.這也說(shuō)明了電場(chǎng)并沒(méi)有使得所有的DiD單分子的偶極取向與電場(chǎng)方向完全一致.

圖4 單分子偶極取向在外電場(chǎng)作用下的極化示意圖(a)電場(chǎng)方向與分子偶極取向同向;(b)電場(chǎng)方向垂直于單分子偶極取向;(c)電場(chǎng)作用于任意取向單分子Fig.4.Simplified scheme of the polarization of the dipole orientation of single-molecule under the influence of external electric field.The directions of the electric field are parallel (a),perpendicular (b),and arbitrary (c)to the dipole orientation of single-molecule,respectively.

4 結(jié) 論

本文利用外部電場(chǎng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)極性單分子偶極取向的操控,并通過(guò)掃描共聚焦熒光成像系統(tǒng)測(cè)量了DiD單分子在外電場(chǎng)下的極化特性.摻雜在PMMA聚合物中的DiD單分子的熒光偏振方向服從單峰高斯分布,其最可幾值為41°;當(dāng)垂直于樣品表面的外電場(chǎng)作用于單分子時(shí),DiD單分子的熒光偏振方向分布沒(méi)有明顯變化;當(dāng)3500 V/mm的外電場(chǎng)平行于樣品表面對(duì)分子作用時(shí),摻雜在PMMA中的DiD單分子的熒光偏振方向發(fā)生明顯變化,呈現(xiàn)雙峰高斯分布,最可幾值為32°和55.5°,說(shuō)明通過(guò)外電場(chǎng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)DiD單分子偶極取向的極化操控.通過(guò)外電場(chǎng)操控單分子偶極取向的方法不需要特定的分子與基質(zhì)材料的組合,可以適用于大多數(shù)極性分子,對(duì)于熒光收集效率的提高及能量轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)的研究具有非常重要的意義.