羅寧 李惠霞 郭靜

摘要 為了解甘肅省隴東南地區(qū)大豆孢囊線蟲(chóng)病分布和發(fā)生程度，采用Z字形取樣法，對(duì)甘肅省隴東南地區(qū)9個(gè)縣（區(qū)）37個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)大豆孢囊線蟲(chóng)病的發(fā)生和分布進(jìn)行調(diào)查，并根據(jù)形態(tài)特征和rDNAITS序列比對(duì)鑒定線蟲(chóng)種類。共采集土樣411份，隴東地區(qū)大豆孢囊線蟲(chóng)檢出率為87.2%，其中鎮(zhèn)原、西峰、正寧、華池和環(huán)縣的檢出率最高，達(dá)100%，鎮(zhèn)原孢囊發(fā)生量最大，平均孢囊數(shù)為11.4個(gè)/100 g土;隴南地區(qū)大豆孢囊線蟲(chóng)檢出率為63.7%，成縣和徽縣分別為64.0%、63.0%，平均孢囊數(shù)分別為0.9和1.2個(gè)/100 g土。經(jīng)形態(tài)學(xué)特征觀測(cè)和rDNAITS序列比對(duì)，甘肅省隴東南采集到的孢囊線蟲(chóng)均鑒定為大豆孢囊線蟲(chóng)Heterodera glycines。

關(guān)鍵詞 大豆孢囊線蟲(chóng)病; 分布; 發(fā)生; 鑒定

中圖分類號(hào)： S 432.45

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018253

Abstract In order to understand the occurrence and distribution of soybean cyst nematode in southeast of Gansu Province， zigzag sampling method was used to investigate soybean cyst nematodes in 37 townships of 9 counties in southeastern Gansu. The species of nematodes were identified based on the morphological observation and rDNAITS sequence analysis. Totally， 411 samples of soil samples were collected. The results showed that the detection rate of soybean cyst nematodes in eastern Gansu was 87.2%， among which the detection rates in Zhenyuan， Xifeng， Zhengning， Huachi and Huan County were the highest， with the rates of 100%， while that in Qingcheng was the lowest by 39.3%. The highest density was found in Zhenyuan with the average cysts number of 11.4 per 100 g soil. The detection rate of soybean cyst nematodes in southern Gansu was 63.7% and those in Chengxian and Huixian were 64.0% and 63.0%， respectively， and average densities of nematodes were 0.9 and 1.2 per 100 g soil， respectively. Morphological observation and rDNAITS sequence analysis showed that the cyst nematodes collected in southeastern Gansu were identified as Heterodera glycines.

Key words soybean cyst nematode disease; distribution; occurrence; identification

大豆孢囊線蟲(chóng)Heterodera glycines是豆類生產(chǎn)上的重要線蟲(chóng)，在世界各主要大豆產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[1]。1899年俄國(guó)人雅切夫斯基等在我國(guó)黑龍江省西部首次發(fā)現(xiàn)大豆孢囊線蟲(chóng)病，隨后巴西、日本、韓國(guó)、朝鮮、美國(guó)、加拿大、哥倫比亞、印度尼西亞、俄羅斯、埃及等國(guó)家相繼報(bào)道了大豆孢囊線蟲(chóng)的發(fā)生[24]。目前，我國(guó)黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、北京、河南、河北、山東、山西、安徽、江蘇、湖北、浙江、上海、新疆、陜西、寧夏和甘肅等地已證實(shí)有大豆孢囊線蟲(chóng)分布[58]。該病一般造成大豆減產(chǎn)5%～10%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)達(dá)30%～50%，甚至絕產(chǎn)[5，910]，嚴(yán)重制約豆類作物生產(chǎn)安全。

近年來(lái)，隨著大豆孢囊線蟲(chóng)在各地嚴(yán)重發(fā)生，貴州、山東、河北、新疆及黑龍江等地對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)開(kāi)展了較系統(tǒng)的研究，但甘肅省相關(guān)研究的報(bào)道較少。葉文興等[11]，Peng等[12]報(bào)道在甘肅省發(fā)現(xiàn)大豆孢囊線蟲(chóng)，但有關(guān)其發(fā)生情況和危害程度尚缺乏了解。

甘肅省種植大豆區(qū)域廣、歷史久，隴東南是甘肅省大豆主產(chǎn)區(qū)，以種植春播大豆為主，多數(shù)地區(qū)小麥、玉米、大豆進(jìn)行輪作，少數(shù)夏播大豆是在小麥和油菜收獲后復(fù)種。目前，大豆孢囊線蟲(chóng)在甘肅省的分布、發(fā)生以及危害情況尚不清楚，一旦大面積發(fā)生，將嚴(yán)重影響甘肅地區(qū)大豆的安全生產(chǎn)。本研究擬對(duì)甘肅隴東南地區(qū)大豆孢囊線蟲(chóng)開(kāi)展調(diào)查研究，以期明確大豆孢囊線蟲(chóng)病在該地區(qū)的分布、發(fā)生程度，并對(duì)病原線蟲(chóng)種類進(jìn)行鑒定，為該病害的及時(shí)有效防治提供依據(jù)。

1.2 孢囊的分離和計(jì)數(shù)

參照李惠霞等[13]的試驗(yàn)方法，隨機(jī)取100 g風(fēng)干后土樣倒入塑料桶內(nèi)，加入自來(lái)水?dāng)嚢枋蛊淠酀{均勻，靜置2～3 min，將上層的懸浮液依次倒入26目和60目的篩網(wǎng)過(guò)濾，重復(fù)3～4次。沖洗26目篩網(wǎng)上的殘留物，使孢囊和細(xì)渣全部沖入60目篩網(wǎng)中，用小水流從正面輕輕淋洗60目篩。沖洗干凈后，用洗氣瓶沖洗60目網(wǎng)篩上的剩余物質(zhì)至尼龍紗上，編號(hào)，在解剖鏡下檢查尼龍紗上的孢囊并計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)孢囊檢出率。

孢囊檢出率=檢測(cè)出孢囊的土樣數(shù)/總土樣數(shù)×100%。

1.3 孢囊線蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)鑒定

從各群體中挑選飽滿孢囊，參照馮志新[14]的方法在體視顯微鏡下用鋒利的解剖刀切下陰門錐，用牙簽或者昆蟲(chóng)針輕輕清除陰門錐內(nèi)側(cè)附著物，轉(zhuǎn)移到40% H2O2中漂白處理4 min。依次轉(zhuǎn)移至70%、95%、100% 乙醇中脫水，制作成臨時(shí)玻片。參照王明祖等[15]的方法鑒定孢囊線蟲(chóng)的種類。

1.4 孢囊線蟲(chóng)DNA的提取

參照彭德良等[16]的方法提取線蟲(chóng)DNA。挑取1個(gè)飽滿孢囊，放入裝有14 μL滅菌重蒸水的Eppendorf管中，加入3 μL10×PCR buffer（含Mg2+）和3 μL蛋白酶K，在液氮中速凍1 min。用乙醇消毒的玻璃棒快速研磨1～2 min。-20℃冷凍2 h，然后將Eppendorf管在65℃下溫育1.5 h，95℃處理10 min，使蛋白酶K變性，離心1 min，取上清DNA懸浮液放入-20℃保存，備用。

1.5 不同地區(qū)大豆孢囊線蟲(chóng)群體的rDNAITS擴(kuò)增及測(cè)序分析

采用25 μL的PCR擴(kuò)增體系[17]：模板DNA 2 μL、通用引物TW81（5′GTTTCCGTAGGTGAACCTGC3′）和AB28（5′ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3′）各1 μL、10×PCR buffer（含Mg2+）2.5 μL、dNTPs 1 μL、Taq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O補(bǔ)足到25 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性4 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)35次;72℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物-20℃保存。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，100 V，30 min，電泳后在紫外燈下觀測(cè)、照相。將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化測(cè)序，進(jìn)行親緣關(guān)系分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘肅隴東南大豆孢囊線蟲(chóng)的分布

本試驗(yàn)采集了甘肅隴東南9個(gè)縣（區(qū)）37個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的411份土壤樣品，調(diào)查結(jié)果表明，295份土壤樣品含有孢囊線蟲(chóng)，孢囊檢出率為71.8%（表2）。所調(diào)查的9縣均有孢囊線蟲(chóng)分布，其中鎮(zhèn)原、西峰、正寧、華池及環(huán)縣的檢出率最高，達(dá)100%。寧縣、徽縣、成縣的孢囊檢出率分別達(dá)到98.2%、63%、64%，檢出率最低的是慶城，為39.3%（表2）。

2.2 甘肅隴東南孢囊線蟲(chóng)發(fā)生程度

由表3可知，甘肅隴東南調(diào)查的9個(gè)縣（區(qū)）均有大豆孢囊線蟲(chóng)發(fā)生，不同地區(qū)大豆孢囊線蟲(chóng)密度差別較大，同一地區(qū)大豆田的孢囊線蟲(chóng)發(fā)生程度也存在差異。平均孢囊數(shù)為5.9個(gè)/100 g土。鎮(zhèn)原和寧縣孢囊線蟲(chóng)發(fā)生程度最為嚴(yán)重，每100 g土樣平均孢囊數(shù)分別為11.4個(gè)和10.7個(gè)，個(gè)別地塊土樣孢囊數(shù)超過(guò)20個(gè);隴南地區(qū)的成縣和徽縣孢囊線蟲(chóng)發(fā)生程度最輕，每100 g土樣平均孢囊數(shù)分別為1.2個(gè)和0.9個(gè)，且35%以上的土樣無(wú)孢囊檢出，60%以上土樣每100 g土中平均孢囊數(shù)在1～5個(gè)之間（表3）。

2.3 孢囊線蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)鑒定

孢囊呈梨形或檸檬形，顏色淺褐色至深褐色（圖1a），長(zhǎng)度為663.1 μm（547.0～752.1 μm）;寬度為457.5 μm（343.3～565.0 μm）;陰門錐下方有較多明顯的長(zhǎng)形泡狀突，具有雙半膜孔，兩膜孔間有發(fā)育良好的下橋（圖1b），陰門膜孔長(zhǎng)度41.4 μm（38.8～43.3 μm）;膜孔寬度40.3 μm（39.3～41.1 μm）;陰門裂長(zhǎng)42.4 μm（36.3～47.8 μm）;下橋長(zhǎng)89.3 μm（82.1～101.8 μm）。本試驗(yàn)研究結(jié)果與劉維志等[6]的測(cè)量結(jié)果基本一致，將其初步鑒定為大豆孢囊線蟲(chóng)H.glycines。

2.4 不同地區(qū)大豆孢囊線蟲(chóng)群體rDNAITS序列分析

對(duì)甘肅省隴東南采集的孢囊線蟲(chóng)群體的rDNAITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增出約1 000 bp的DNA片段（圖2）。選擇具有代表性群體在GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果表明采自隴東西坡（GsXp，MH371304）、玄馬（GsXm，MH371375）、洪得（GsHd，MH371378）、焦作（GsJz，MH375356）、肖金（GsXj，MH375357）、上肖（GsSx，MH375358）、隴南拋沙（GsPs，MH375376）的孢囊線蟲(chóng)群體rDNAITS序列與來(lái)自美國(guó)的大豆孢囊線蟲(chóng)群體（Clone3460）ITS序列（KY794755）相似度達(dá)99%;而隴東焦作、隴南拋沙兩個(gè)群體的rDNAITS序列與來(lái)自我國(guó)山東的大豆孢囊線蟲(chóng)群體（YS1）ITS序列（JQ068764）、伊朗大豆孢囊線蟲(chóng)群體（Did38）ITS序列（JX024210）相似性達(dá)100%。綜上，根據(jù)形態(tài)觀察和ITS序列分析，確定甘肅省隴東南地區(qū)寄生在大豆上的孢囊線蟲(chóng)均為大豆孢囊線蟲(chóng)H.glycines。

3 討論

大豆孢囊線蟲(chóng)屬于孢囊線蟲(chóng)屬Heterodera，是一種土傳的定居性內(nèi)寄生線蟲(chóng)，也是具有毀滅性危害的植物線蟲(chóng)。大豆孢囊線蟲(chóng)可在顯微鏡下通過(guò)觀察孢囊形態(tài)進(jìn)行鑒別，成熟的孢囊為檸檬形或梨形，淺褐色至深褐色，頸部和尾部有明顯突出，陰門錐雙半膜孔，陰門裂較長(zhǎng)，兩膜孔間的下橋明顯[18]。本試驗(yàn)采集的孢囊線蟲(chóng)經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定和rDNAITS序列分析表明均是大豆孢囊線蟲(chóng)，與葉文興等[12]的鑒定結(jié)果一致。

大豆孢囊線蟲(chóng)可通過(guò)跨區(qū)作業(yè)的收割器械，水流及沙塵暴等傳播。甘肅與青海、陜西、寧夏和新疆四省相鄰，而新疆、陜西和寧夏均發(fā)現(xiàn)大豆孢囊線蟲(chóng)病[19]。2003年，張俊立等[20]在河北省采集大豆根際土壤樣品65份，大豆孢囊線蟲(chóng)檢出率高達(dá)73.93%。宋美靜等[21]對(duì)全國(guó)20個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)）的大豆孢囊線蟲(chóng)進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果總檢出率達(dá)69.4%，其中東北和黃淮海地區(qū)發(fā)生率最高，滄州、長(zhǎng)春和黑河地區(qū)檢出率高達(dá)100%。黑龍江省35個(gè)地區(qū)大豆孢囊線蟲(chóng)的發(fā)生率高達(dá)100%，每年造成的損失高達(dá)數(shù)十億元[22]。龍海波等[23]對(duì)貴州省大豆孢囊線蟲(chóng)的發(fā)生和危害進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明總檢出率僅為28.2%，但大方縣和赫章縣發(fā)生嚴(yán)重，檢出率超過(guò)40%。本試驗(yàn)表明，甘肅省大豆主產(chǎn)地區(qū)大豆孢囊線蟲(chóng)的發(fā)生較普遍，隴東地區(qū)大豆孢囊線蟲(chóng)的檢出率為87.2%，隴南地區(qū)大豆孢囊線蟲(chóng)的檢出率為63.7%。在本試驗(yàn)中，慶陽(yáng)地區(qū)大豆孢囊檢出率高于隴南，可能是由于隴南降雨量遠(yuǎn)大于慶陽(yáng)，而大豆孢囊最適宜孵化的土壤含水量為10%～25%[24]，土壤含水量過(guò)高會(huì)抑制孢囊線蟲(chóng)的繁殖;隴南地區(qū)長(zhǎng)期實(shí)施小麥、馬鈴薯、玉米和大豆輪作種植，也是導(dǎo)致大豆孢囊線蟲(chóng)發(fā)生率低的原因。

大豆是甘肅隴東南地區(qū)主要經(jīng)濟(jì)作物，目前甘肅省種植面積保持在13.33萬(wàn)～15.33萬(wàn)hm2，隴東地區(qū)面積最大，達(dá)到10萬(wàn)hm2[25]。本研究表明，隴東地區(qū)檢出率為87.2%，由此可推算出僅隴東地區(qū)大豆孢囊線蟲(chóng)病的發(fā)生面積約為8.7萬(wàn)hm2。甘肅省地處黃土、青藏和蒙古三大高原交匯地帶，氣候類型多樣，且位于黃河上游，沙塵和黃河灌溉水加劇了大豆孢囊線蟲(chóng)的傳播和蔓延。隴南地區(qū)氣候溫和，屬東亞季風(fēng)氣候;隴東地區(qū)屬半干旱區(qū)，年均降水量500 mm，是典型大陸性氣候，適宜大豆孢囊線蟲(chóng)病發(fā)生。

大豆孢囊線蟲(chóng)病是一種積年流行病害，且病情逐年加重。在實(shí)際生產(chǎn)中種植抗耐病品種輪作、噴施化學(xué)藥劑及生物防治等措施均對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)病有一定的防治作用[26]，但這些措施都存在局限性，輪作周期長(zhǎng)，在有限的耕地資源內(nèi)不易實(shí)現(xiàn)，生物防治在大田中不穩(wěn)定，易受環(huán)境影響，常用殺線劑成本較高且污染環(huán)境，農(nóng)戶難以接受。大豆孢囊線蟲(chóng)理論上存在16個(gè)生理小種[27]，連續(xù)種植抗病品種會(huì)改變生理小種，導(dǎo)致育種的難度增加。因此，應(yīng)進(jìn)一步研究甘肅省大豆孢囊線蟲(chóng)的侵染規(guī)律、生理小種類型，探明該病害防治關(guān)鍵期，通過(guò)田間試驗(yàn)篩選出生防制劑和高效低毒的殺線劑，為今后甘肅省大豆孢囊線蟲(chóng)的防治奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）