鄧旭坤，付千，舒廣文，鄭燕，徐瑞,邱韻涵，段歡,余惠凡

(1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074;2 淮北職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)系，淮北235000；3 睢寧縣人民醫(yī)院 藥劑科，徐州221200；4 湖北醫(yī)藥學(xué)院 武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，十堰442000)

順鉑(cisplatin，CP)被廣泛應(yīng)用于治療各種類型的癌癥，包括睪丸癌、宮頸癌、頸癌和非小細(xì)胞肺癌等[1]，但其誘發(fā)的耳毒性、神經(jīng)毒性、惡心、嘔吐和腎毒性等副作用嚴(yán)重限制了其在臨床上的應(yīng)用，尤其是腎毒性.順鉑致腎損傷機(jī)制仍尚未完全明確，但有報(bào)道發(fā)現(xiàn)幾種機(jī)制涉及順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷，其中包括氧化應(yīng)激、炎癥和凋亡等[2].因此，從天然產(chǎn)品中獲得安全的活性化合物并將其用于預(yù)防和治療順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷具有重要意義.

鞣花酸(Ellagic acid, EA)是一種源自于富含多酚鞣質(zhì)的各種堅(jiān)果軟果，如石榴、五倍子、覆盆子、藍(lán)莓、樹莓、黑莓等植物組織中的天然多酚化合物[3].具有抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、抗肝損傷[6]、抗菌[7]、抗突變和抗病毒[8]等多種藥理作用，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域.目前國內(nèi)外對鞣花酸相關(guān)腎損傷的保護(hù)作用研究甚少.本文旨在探究鞣花酸對順鉑引起的小鼠腎損傷的影響及其可能機(jī)制，為臨床上預(yù)防和治療順鉑引起的腎毒性提供參考.

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試藥和儀器

8周齡雄性昆明種小鼠32只，(22±2)g，購自湖北省疾病預(yù)防控制中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可號：SCXK(鄂)2015-0003.小鼠每天給予充足的水和飼料，1周后開始實(shí)驗(yàn).

順鉑(山東齊魯制藥，批號:7F013A89)；鞣花酸(EA,純度98%，寶雞市辰光科技)；兔單克隆Bax、Bcl-2、鼠抗 β-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(Proteintech Group)；Hoechst 33258、Tunel試劑盒(Beyotime Co.Ltd)；肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、微量還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒(南京建成生物研究所)；腫瘤壞死因子α (TNF-α)、白介素1β(IL-1β)試劑盒(Beyotime Biotechnology).

多功能酶標(biāo)儀(SMP-R8，北京維德維康)；電子天平(TX223L型,日本島津)；低溫高速離心機(jī)(FC5515R型，旭日實(shí)驗(yàn)儀器)；超聲波清洗器(YQ-010型，上海易凈)；微型旋渦混合儀(XH-C，旭日實(shí)驗(yàn)儀器)；低速離心機(jī)(TD5Z型，常州市金壇高科儀器廠)；脫色搖床(WD-9405C，北京市六一儀器廠)；電泳儀(DYY-11，B北京市六一儀器廠).

1.2 動(dòng)物造模

取雄性昆明小鼠32只，隨機(jī)分為對照組、模型組、EA給藥組(10, 30 mg/kg)，每組8只.對照組小鼠灌胃生理鹽水，持續(xù)10 d.給藥組連續(xù)灌胃不同劑量鞣花酸7 d，第7天給藥2 h后，除對照組外均單次腹腔注射順鉑(25 mg/kg)，給藥組再灌胃3 d.摘取眼球取血離心得到血清并立即處死小鼠，取出腎臟稱重并記錄(冰上進(jìn)行所有操作)，左腎放入組織固定液中，用于組織病理學(xué)等檢查；右腎用于氧化應(yīng)激指標(biāo)及Western bolting等測定.

1.3 腎指數(shù)、體重變化及尿蛋白的測定

每日記錄小鼠給藥前體重，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算體重變化.給予順鉑3 d后收集小鼠尿液并稱重，將小鼠腎臟于冰生理鹽水中洗凈并記錄其重量，計(jì)算小鼠的臟器指數(shù)：臟器指數(shù)/%=臟器重量/最終體重×100.用Bradford法檢測尿蛋白濃度.

1.4 腎功能指標(biāo)、TNF-α和 IL-1β含量測定

參照文獻(xiàn)[9]將剛?cè)〕龅难悍胖糜谑覝?，待其凝固后?000 r/min 離心10 min，分離血清.試劑盒檢測Cr和BUN含量；ELISA試劑盒測定血清中TNF-α和IL-1β的含量.根據(jù)試劑盒說明測定其相關(guān)OD值，繪制標(biāo)曲并計(jì)算含量.

1.5 腎組織中GSH和T-SOD含量的測定

將小鼠右腎在冰生理鹽水中反復(fù)沖洗，按腎組織重量(g)∶生理鹽水體積(mL)=1∶9 的比例制成10%勻漿液，3000 r/min，離心10 min，取上清液按照各測試盒操作方法測定T-SOD和GSH含量.

1.6 Western blotting檢測Bax和Bcl-2表達(dá)

將腎組織放入RIPA裂解液中提取腎組織總蛋白，再加入5×上樣緩沖液[V(裂解液)∶V(緩沖液)=4∶1]，沸水煮5 min使其變性.在12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分離蛋白質(zhì).將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上.室溫下，將轉(zhuǎn)好的PVDF膜與5%的脫脂奶粉一起孵育來來阻斷非特異性結(jié)合.用TBST洗滌3次并與Bax(1∶1000)、Bcl-2(1∶1000)和β-actin(1∶1000)一起室溫孵育2 h.用TBST洗滌4次后，將膜與山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗(1∶1000)室溫下孵育1 h. TBST洗膜后，用BeyoECL Plus A液和B液按1∶1混勻進(jìn)行顯色，Image J 分析軟件定量和分析蛋白質(zhì)條帶的密度.

1.7 腎組織病理形態(tài)學(xué)檢查

將腎組織固定在10%福爾馬林溶液中并包埋于石蠟中，將固定好的組織進(jìn)行切片，厚度4～5 μm.按照標(biāo)準(zhǔn)的方法用蘇木精-伊紅(HE)進(jìn)行染色,滴加中性樹膠封片，200×顯微鏡下觀察、拍照.

1.8 Tunel檢測

取腎組織石蠟切片，切片在65 ℃干燥1 min后進(jìn)行常規(guī)脫蠟水化，輕輕將切片表面的蒸餾水拭干，37 ℃下蛋白酶K消化30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，細(xì)胞通透后加Tunel反應(yīng)液并按試劑盒說明進(jìn)行操作.待PBS洗滌后，再參照DAPI試劑盒進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察(×200).

1.9 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 EA對腎損傷小鼠體重、腎指數(shù)的影響

EA對腎損傷小鼠體重、腎指數(shù)的影響結(jié)果見表1.由表1可見：與對照組相比，模型組小鼠體重顯著下降，腎臟指數(shù)顯著增大(P<0.001)，說明腎臟受損腫大；與模型組相比，EA預(yù)防后能明顯改善小鼠體重和腎臟指數(shù)的變化(P<0.01或P<0.001)，并呈一定的量效關(guān)系.

表1 EA對腎損傷小鼠體重、腎指數(shù)的影響Tab.1 Effect of EA on body weight, kidney index in mice with renal injury

注：與正常組比較，###P<0.001；與模型組比較，**P<0.01，***P<0.001

2.2 EA對腎損傷小鼠腎功能的影響

EA對腎損傷小鼠腎功能的影響結(jié)果見圖1.由圖1可見：與對照組比較，模型組小鼠尿量明顯減少，尿蛋白、BUN和Cr顯著增高(P<0.001)，表明順鉑引起的腎損傷造模成功；與模型組比較，EA組小鼠尿量增多，尿蛋白、BUN和Cr明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01或P<0.001)，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系.

與對照組比較，##P<0.01,###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖1 EA對腎損傷小鼠腎功能的影響Fig.1 Effect of EA on renal function in mice with renal injury

2.3 EA對腎損傷小鼠TNF-α和IL-1β水平的影響

EA對腎損傷小鼠TNF-α和IL-1β水平的影響結(jié)果見表2.

表2 EA對腎損傷小鼠TNF-α和IL-1β水平的影響Tab.2 Effect of EA on the levels of TNF-α and IL-1β in mice with renal injury

注：與對照組比較，###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05，

**P<0.01，***P<0.001

由表2可見：與對照組相比，模型組小鼠炎癥相關(guān)因子TNF-α和IL-1β水平明顯升高(P<0.01或P<0.001)；而與模型組相比，EA給藥后能夠降低炎癥相關(guān)因子的水平(P<0.05,P<0.01或P<0.001)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.說明EA能夠通過抑制炎癥因子的表達(dá)來改善順鉑引起的腎損傷.

2.4 EA對腎損傷小鼠腎組織中GSH和T-SOD含量的影響

EA對腎損傷小鼠腎組織中GSH和T-SOD含量的影響結(jié)果見圖2.由圖2可見：與對照組相比，模型組小鼠在注射順鉑后腎組織中GSH和T-SOD含量顯著減少，MDA含量顯著升高(P<0.01或P<0.001)；與模型組相比，EA預(yù)防后GSH和T-SOD含量明顯增高，MDA含量明顯降低(P< 0.05或P< 0.01).說明EA能夠通過改善抗氧化水平從而改善順鉑引起的腎損傷.

與正常組比較，##P<0.01,###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01圖2 EA對腎損傷小鼠腎組織中和GSH、T-SOD和MDA含量的影響Fig.2 Effect of EA on the contents of GSH,T-SOD and MDA in renal tissues of mice with renal injury

2.5 EA對腎損傷小鼠腎組織病理變化影響

EA對腎損傷小鼠腎組織病理變化影響結(jié)果見圖3.由圖3可見：對照組腎組織中正常的腎小球和腎小管，無變性和壞死以及白細(xì)胞浸潤等病理現(xiàn)象；而模型組小鼠腎臟中出現(xiàn)了腎小管擴(kuò)張和變性，管間出血，腎小球充血腫脹及大量白細(xì)胞浸潤；相比模型組，順鉑引起的病理變化在EA的預(yù)防下均獲得了劑量依賴性抑制.說明EA的預(yù)防對腎組織的病理損傷具有明顯的改善作用.

圖3 EA對腎損傷小鼠腎組織中病理變化的影響(×200)Fig.3 Effect of EA on the pathological changes in renal tissues of mice with renal injury(×200)

2.6 EA對腎損傷小鼠細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

EA對腎損傷小鼠細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖4.由圖4可見：促凋亡蛋白(Bax)和抗凋亡蛋白(Bcl-2)是細(xì)胞凋亡中重要的因子，與對照組相比，模型組小鼠腎組織中Bax 蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)，Bcl-2的表達(dá)顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，EA預(yù)防后Bax蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)，Bcl-2 表達(dá)升高(P<0.01)，但均未恢復(fù)到正常水平.

與正常組比較，##P<0.01,與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01圖4 EA對腎損傷小鼠細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of EA on the expression ofBcl-2 and Bax protein in cell of mice with renal injury

2.7 EA對腎損傷小鼠腎組織中細(xì)胞凋亡的影響

EA對腎損傷小鼠腎組織中細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果見圖5.圖5中Tunel染色結(jié)果表明：對照組基本無紅色熒光的細(xì)胞核，說明無凋亡細(xì)胞；而順鉑造模后明顯可見大量破碎的細(xì)胞核，凋亡細(xì)胞較對照組明顯增多；EA預(yù)防后凋亡細(xì)胞較模型組顯著減少，說明EA能夠通過抑制細(xì)胞凋亡改善順鉑誘導(dǎo)的腎損傷.

圖5 EA對腎損傷小鼠腎組織中細(xì)胞凋亡的影響(×200)Fig.5 Effect of EA on apoptosis in renal tissues of mice with renal injury(×200)

3 討論

腎臟是機(jī)體生成尿液，清除代謝產(chǎn)物、毒物，保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要器官.順鉑是治療癌癥的首選藥物之一，但在治療癌癥時(shí)會在近端腎小管細(xì)胞中積累，誘發(fā)嚴(yán)重的腎毒性[10].因此，研發(fā)能保護(hù)順鉑誘導(dǎo)的腎毒性的天然藥物至關(guān)重要，本文研究了EA對順鉑引起急性腎損害的保護(hù)作用.

BUN、Cr和尿蛋白是臨床上常用的腎功能相關(guān)指標(biāo)，可通過腎小球?yàn)V過功能的損害程度來反映腎功能狀態(tài)和腎臟損傷狀況.研究結(jié)果表明：小鼠注射順鉑后BUN、Cr和尿蛋白水平顯著升高，炎癥相關(guān)因子TNF-α和IL-1β 水平明顯上升，非酶抗氧化劑GSH和T-SOD含量顯著降低，脂質(zhì)過氧化主要產(chǎn)物MDA含量顯著升高，表明順鉑引起的腎損傷模型構(gòu)建成功；在損傷的同時(shí)出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，組織病理學(xué)檢查的結(jié)果進(jìn)一步支持了生化檢測的結(jié)論.EA預(yù)處理均能改善這些指標(biāo)，說明EA預(yù)處理后部分恢復(fù)了腎臟功能，并能抑制順鉑引起的炎癥并破壞腎臟的抗氧化防御機(jī)制.

研究報(bào)道[10]順鉑誘導(dǎo)的腎毒性主要發(fā)生在近端腎小管上皮細(xì)胞中，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：腹腔注射順鉑后，在小鼠的腎組織中順鉑顯著增加了促凋亡蛋白Bax并降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平；EA給藥后，Bax蛋白表達(dá)減少和Bcl-2蛋白表達(dá)增加，表明EA是通過抑制腎小管上皮細(xì)胞的凋亡來抑制順鉑引起的腎損傷.Tunel檢測結(jié)果進(jìn)一步證明了EA可通過抑制細(xì)胞凋亡來改善順鉑的腎損傷.

綜上，EA對順鉑引起的腎損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制主要與EA的抗氧化、減少炎癥反應(yīng)和抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡有關(guān).