張瓊光, 龔韋凡，梅枝意，黃先菊，楊光忠，李竣*

(1 國家藥品監(jiān)督管理局食品藥品審核查驗中心, 北京100061; 2 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院, 武漢430074)

龍膽科黃秦艽屬植物黃秦艽Veratrillabaillonii.，又名滇黃芩、麗江金不換、大苦參、黃龍膽，主要分布于我國四川、云南、西藏等地.黃秦艽是云南地方常用中草藥，被收載于1974 年和2005年版《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》，其以根入藥，具有清熱解毒、消炎殺蟲等功效，在臨床上主要用于治療肺熱咳嗽、阿米巴痢疾、黃疸型肝炎和蛔蟲病[1].有關(guān)黃秦艽化學(xué)成分的研究較少，目前證明其主要化學(xué)成分是黃酮類化合物[2,3].本研究前期從黃秦艽藥材的醇提物中分離并鑒定出26個化合物，其中含有6種環(huán)烯醚萜類化合物[4].本文擬通過指紋圖譜與單體化合物的比對，及總黃酮和總環(huán)烯醚萜含量測定方法的建立，為黃秦艽的質(zhì)量控制、產(chǎn)品的生產(chǎn)制備工藝優(yōu)化及進(jìn)一步開發(fā)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)[5-7].

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(DIONEX Ultimate 2000，DIONEX，美國)；色譜柱(Phenomenex Synergi 4μ Polar-RP 80A 00G-4336-E0，Phenomenex，美國)，UV-1800紫外-可見分光光度計(UV-1800，上海美譜達(dá))；超純水儀(Milli-Q plus system，美國Millipore)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE 52-98型，上海亞榮)；旋片真空泵(2XZ-1型，浙江黃巖天龍真空泵廠)；超聲儀(KQ-500E型，昆山市超聲儀器)；電子天平(AUW-120D型，日本島津)；電熱恒溫水槽(DK-8B型，上海精宏).

1.2 試藥

1-羥基-2,3,4-三甲氧基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基口山酮、Tetraswerosides A、Secamonoides B、1-羥基-2,7-二甲氧基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基口山酮、2,3,4,7-四甲氧基1-O-櫻草糖氧基口山酮、當(dāng)藥苷、龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、1-羥基-3,4-二甲氧基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基口山酮、鄰苯二甲酸二異丁酯、1,7-二羥基-2,3,4-三甲氧基口山酮、1-羥基-2,3,5-三甲氧基口山酮、1-羥基-2,3,4,7-三甲氧基口山酮、Tripteroside、金不換苷B、2,3,5-三甲氧基-1-O-櫻草糖氧基口山酮、2,3,4,5-四甲氧基口山酮-1-O-龍膽二糖苷、富馬酸二丁酯、1,7-二羥基-3,4-二甲氧基口山酮、1,3-二羥基-4,7-二甲氧基口山酮、1,7-二羥基-3-甲氧基口山酮、1-羥基-2,3,4,5-四甲氧基口山酮、1-羥基-2,3,7-三甲氧基口山酮、2′-間羥基苯甲酰獐牙菜苷、Amaronitidin、苦杏仁苷均為實驗室自制；乙腈(色譜純，美國Tedia)；其他均為分析純(國藥集團化學(xué)試劑).

2 方法與結(jié)果

2.1 黃秦艽化學(xué)成分分析

2.1.1 色譜條件

Phenomenex Synergi色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈和0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長為254 nm，進(jìn)樣量為10 μL[8,9].(程序見表1)

表1 黃秦艽HPLC指紋圖譜梯度洗脫時間順序Tab.1 Gradient elution time sequence of HPLC fingerprints of V.baillonii.

2.1.2 樣品溶液的制備

黃秦艽樣品粉碎過40目篩，稱取0.5 g粉末，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇精密稱定并定容，超聲20 min提取，放置室溫，甲醇補足質(zhì)量后搖勻，以0.45 μm微孔濾膜過濾，棄初濾液，取續(xù)濾液為供試品溶液，以2.1.1色譜條件分析，得到黃秦艽的指紋圖譜(見圖1)，標(biāo)定色譜峰.單次進(jìn)樣所分離的化合物，對上述色譜峰進(jìn)行定性分析，結(jié)果見表2.

圖1 黃秦艽醇提物指紋圖譜Fig.1 Figureprint HPLC of ethanol extract from V. baillonii.

表2 黃秦艽HPLC成分分析結(jié)果Tab.2 HPLC identification results of V. baillonii.

*峰號26苦杏仁苷未檢出

2.2 黃秦艽醇提物總黃酮含量測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取1-羥基-2,3,4,5-四甲氧基口山酮對照品10.10 mg，甲醇溶解，制成0.101 mg/mL的對照品溶液.

2.2.2 供試品溶液的制備

將黃秦艽藥材粉碎，過40目篩，稱取1.0 g粉末，置于圓底燒瓶中，加入20 mL甲醇，加熱回流提取3次，每次 2 h，放冷，提取液減壓濃縮，轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，甲醇定容，振搖均勻，得供試品溶液.

2.2.3 顯色與測定方法

取對照品溶液和供試品溶液各1.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，依次加入5%NaNO2溶液(即100 mL溶液中含有5 gNaNO2，下同)和10% Al(NO3)31.0 mL，每次混勻靜置6 min，加入4% NaOH溶液10 mL，甲醇定容混合均勻，保溫靜置15 min，陰性實驗按上述方法進(jìn)行，在353 nm波長處測定吸光度.

2.2.4 專屬性實驗

取對照品、陰性對照及供試品溶液各1.0 mL，按“2.2.3”項下顯色與測定，在200～600 nm范圍進(jìn)行全波長掃描(間隔1 nm).結(jié)果顯示對照品及供試品溶液均在353 nm波長處有最大吸收，陰性對照無吸收.

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取對照品溶液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，按“2.2.3”項下方法操作，在λmax=353 nm 波長處分別測定吸光度(A).以吸光度值為縱坐標(biāo)Y，濃度(μg /mL) 為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為:Y=0.03X+0.3867(r=0.9995).結(jié)果表明，1-羥基-2,3,4,5-四甲氧基口山酮對照品溶液在 2.0～10.1 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系.

2.2.6 方法學(xué)考察

精密度試驗：取系列濃度對照品溶液中的任意一份，按“2.2.3”項下的操作方法處理后，連續(xù)用紫外分光光度計于353 nm處掃描5次，記錄吸光度，計算RSD值為0.43%，表明儀器的精密度良好.

穩(wěn)定性試驗：供試品溶液按“2.2.3”項下的操作方法處理后，分別在0，15，30，60，120，240，360 min測定吸光度，計算RSD值為0.32%，表明樣品溶液在360 min內(nèi)穩(wěn)定性良好.

重復(fù)性試驗：制備3份供試品溶液，按“2.2.3”項下的操作方法處理后，分別測定吸光度，計算RSD值為1.5 %，表明該含量測定方法重復(fù)性良好.

2.2.7 加樣回收率試驗

精密稱量6份已知含量的黃秦艽藥材粉末，按“2.2.2”項下方法制備6份供試品溶液，分別精密加入不同量的1-羥基-2,3,4,5-四甲氧基口山酮對照品溶液，按照“2.2.3”項的反應(yīng)條件測定，結(jié)果黃秦艽的平均加樣回收率為97.7%，RSD為0.4%(見表3).表明該含量測定方法的準(zhǔn)確度良好可靠，加樣回收率實驗數(shù)據(jù).

2.2.8 供試品總黃酮含量測定

將供試品溶液按“2.2.3”項下的操作方法處理后，測定吸光度，重復(fù)6次.結(jié)果該黃秦艽藥材醇提物中總黃酮的平均含量為31.25%，RSD=0.13%.

表3 黃秦艽總黃酮的加樣回收率結(jié)果(n=6)Tab.3 Recovery results of total flavonoids from V. baillonii

2.3 總環(huán)烯醚萜含量測定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取龍膽苦苷對照品7.70 mg，甲醇溶解，制成0.077 mg /mL 的對照品溶液.

2.3.2 供試品溶液的制備

將黃秦艽藥材粉碎，過40目篩，稱取1.0 g樣品粉末，置于圓底燒瓶中，按“2.2.2”項下方法制備，即得供試品溶液.

2.3.3 顯色與測定方法

精密吸取對照品溶液1.0 mL，干燥，加入5%香草醛高氯酸試液0.5 mL，混勻，置于70 ℃恒溫水浴鍋上水浴加熱90 min.水浴加熱完成后，用冰水冷卻試管2 min，加入體積比為77%濃硫酸溶液5 mL，振搖均勻，直至溶液顏色一致.陰性實驗按上述方法進(jìn)行，在540 nm波長處測定吸光度.

2.3.4 專屬性實驗

取對照品、陰性對照及供試品溶液各1.0 mL，按“2.3.3”項下顯色與測定，以紫外分光光度計在200～600 nm進(jìn)行全波長掃描(間隔1 nm).結(jié)果顯示，對照品及供試品溶液均在540 nm波長處有最大吸收，陰性對照無吸收，故以540 nm為樣品的測定波長.

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取對照品溶液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，按“2.3.3”項下的方法操作，在λmax=540 nm 波長處分別測定吸光度(A).得線性回歸方程為:Y=0.0059X+0.3012(r=0.9997).表明龍膽苦苷對照品溶液在15.4～77.0 μg /mL內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.3.6 方法學(xué)考察

精密度試驗：取系列濃度對照品溶液中的任意一份，按“2.3.3”項下的操作方法處理后，連續(xù)用紫外分光光度計于540 nm處掃描5次，記錄吸光度，計算RSD值為0.68%，表明儀器的精密度良好.

穩(wěn)定性試驗：供試品溶液按“2.3.3”項下的操作方法處理后，分別在0, 0.5, 1.0, 1.5, 2 h測定吸光度，計算RSD值為0.57%，表明樣品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

重復(fù)性試驗：制備份供試品溶液，按“2.3.3”項下的操作方法處理后，分別測定吸光度，計算RSD值別為0.55%，表明該含量測定方法重復(fù)性良好.

2.3.7 加樣回收率試驗

精密稱量9份已知含量的黃秦艽藥材粉末，按“2.2.2”項下方法制備9份供試品溶液，分別精密加入不同量的龍膽苦苷對照品溶液，制備3個不同濃度的樣品，每個濃度平行測定3份，按照“2.3.3”項的反應(yīng)條件測定，結(jié)果黃秦艽的平均加樣回收率為98.4%，RSD為1.0%.表明該含量測定方法的準(zhǔn)確度良好可靠，加樣回收率實驗數(shù)據(jù)見表4.

表4 黃秦艽總環(huán)烯醚萜的加樣回收率實驗結(jié)果(n = 9)Tab.4 Recovery results of total iridoids from V.baillonii

2.3.8 供試品總環(huán)烯醚萜含量測定

將供試品溶液按“2.3.3”項下的操作方法處理后，測定吸光度，重復(fù)6次.結(jié)果該黃秦艽藥材醇提物中總環(huán)烯醚萜的平均含量為20.91%，RSD=0.38%.

3 結(jié)語

本文以黃秦艽藥材為研究對象，以前期從黃秦艽中分離鑒定的單體成分作為樣品，建立了黃秦艽醇提物HPLC指紋圖譜分析方法和完整的指紋圖譜，通過黃秦艽醇提物指紋圖譜可知：黃秦艽主要化學(xué)成分為口山酮和環(huán)烯醚萜類，其中黃秦艽中相對含量較高的組分為龍膽苦苷(峰6)、Tripteroside(峰7)、1,3-二羥基-4,7-二甲氧基口山酮(峰20)、1-羥基-2,3,5 -三甲氧基口山酮(峰22)、1-羥基-2,3,4,5-四甲氧基口山酮(峰23)、1-羥基-2,3,7 -三甲氧基口山酮(峰24)、1-羥基-2,3,4,7-四甲氧基口山酮(峰25).

藥材總黃酮含量測定的方法常選用蘆丁作為對照品，經(jīng)顯色后UV最大吸收波長在510 nm處，但預(yù)實驗中樣品在510 nm處未出現(xiàn)吸收.黃秦艽根部的黃酮屬于口山酮類化合物，較少出現(xiàn)鄰二酚羥基或蘆丁的5-羥基與羰基形成絡(luò)合物顯色，因此在測定黃秦艽總黃酮時不宜使用蘆丁作為對照品，故選取從黃秦艽中得到的1-羥基-2,3,4,5-四甲氧基口山酮作為標(biāo)準(zhǔn)品測定總黃酮含量.

黃秦艽作為傳統(tǒng)的民族藥在民間廣泛的使用[10]，但其藥材中總環(huán)烯醚萜和總黃酮類藥效成分含量尚未見文獻(xiàn)報道.為了解黃秦艽藥材品質(zhì)的優(yōu)劣，規(guī)范其臨床使用標(biāo)準(zhǔn)，本文通過紫外分光光度法測定黃秦艽醇提物的總黃酮和總環(huán)烯醚萜的含量，確定了黃秦艽中24個主要成分的HPLC指紋圖譜，建立了一種新的控制黃秦艽藥材質(zhì)量方法，為黃秦艽藥材的質(zhì)控和開發(fā)提供了理論依據(jù).