熊憲獻(xiàn)， 劉 婷， 楊云龍， 孫 啟， 金光明， 靳二輝

(安徽科技學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，細(xì)菌耐藥性、藥物殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題日趨嚴(yán)重，研發(fā)新型綠色安全的飼料添加劑，以減少抗生素的使用，已經(jīng)成為畜禽養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的迫切要求。中草藥作為飼料添加劑具有資源豐富，毒副作用小、無(wú)耐藥性、多靶點(diǎn)、多功效等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在畜禽生產(chǎn)中應(yīng)用不僅可以防治疾病，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，還可為動(dòng)物補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高免疫力，改善肉品質(zhì)及產(chǎn)品風(fēng)味。如肉雞日糧中添加烏梅、大青葉、柴胡等中草藥能顯著改善肉雞胸肌的彈性、咀嚼性和亮度，提高肌肉品質(zhì)[1]。日糧中添加連翹提取物、黃連素能夠提高自由基清除能力、降低氧化應(yīng)激，增加腸道有益菌群水平，改善肉雞高飼養(yǎng)密度條件下的生長(zhǎng)性能[2]。祁宏偉等[3]研究表明在AA肉雞的基礎(chǔ)日糧中添加750 mg的大豆提取物可顯著促進(jìn)肉仔雞脾臟IFN-γ和IL-2 mRNA表達(dá)，提高機(jī)體免疫水平，增強(qiáng)機(jī)體特異性免疫功能。歐紅萍等[4]研究顯示，在飼料中添加1.0%復(fù)方中藥“豬康散”可顯著促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞增殖和降低脾淋巴細(xì)胞凋亡率，提高豬體免疫能力。

以上研究充分表明，在飼料中添加單一或復(fù)合中草藥可一定程度上提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和抗氧化功能，改善肉品質(zhì)，增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗病能力。然而，中草藥種類繁多，不同中草藥或中草藥復(fù)方對(duì)動(dòng)物機(jī)體生理功能的影響存在一定差異性，且中草藥組方對(duì)肉雞免疫器官細(xì)胞增殖凋亡的影響報(bào)道較少。脾臟是機(jī)體最大的周圍淋巴器官，是免疫反應(yīng)的主要場(chǎng)所，其在維持動(dòng)物機(jī)體正常免疫功能中起著至關(guān)重要的作用。因此，本試驗(yàn)以青腳麻雞為研究對(duì)象，通過(guò)添加自制的中草藥組方，研究其對(duì)脾臟發(fā)育、抗氧化功能和細(xì)胞增殖凋亡的影響，為中草藥資源開(kāi)發(fā)及在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與飼養(yǎng)管理

選用400只剛出殼健康青腳麻雞，購(gòu)于鳳陽(yáng)縣牧源家禽養(yǎng)殖專業(yè)合作社。按照體重相近原則隨機(jī)分為對(duì)照組和3個(gè)復(fù)方中草藥添加劑組(試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組)，每組100羽(包含5個(gè)重復(fù)，n=20)。對(duì)照組飼喂未添加復(fù)方中草藥的玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)Ⅰ-Ⅲ組分別按照0.5%、1.0%、1.5%的水平在日糧中添加復(fù)方中草藥，采用層疊式籠養(yǎng)，自由采食和飲水，雞舍溫度、濕度和光照均按照肉雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制。飼養(yǎng)試驗(yàn)持續(xù)56 d。按照常規(guī)肉雞免疫程序?qū)η嗄_麻雞進(jìn)行免疫接種。

1.2 復(fù)方中草藥組成及主要有效成分含量

本試驗(yàn)添加的復(fù)方中草藥組分主要包括金銀花、黃連、蒲公英、紫花地丁、黃芪和甘草。采用超微粉碎機(jī)逐一粉碎后按比例混勻。采用分光光度法和液相色譜法檢測(cè)主要有效成分為：總多糖1.86%，總黃酮25.63%，黃連素1 009.23 mg/kg。

1.3 基礎(chǔ)日糧

本試驗(yàn)中青腳麻雞飼喂的基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)成分參照經(jīng)典的方法進(jìn)行配制和檢測(cè)[5]。

1.4 樣本采集與處理

分別于28和56日齡，每組隨機(jī)選取青腳麻雞15羽(每個(gè)重復(fù)3羽)，禁食12 h，稱重后頸動(dòng)脈放血致死，迅速解剖分離脾臟，一部分經(jīng)液氮冷凍后，置于-80 ℃冰箱保存，另一部分固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中。

1.5 脾臟重量和指數(shù)測(cè)定

青腳麻雞致死后，逐項(xiàng)分離氣管、食道、嗉囊、腸、脾臟、胰腺、膽、生殖器官，再逐項(xiàng)分離頭、爪、心、肺、肝、腎、腺胃、肌胃以及腹部脂肪，稱量全凈膛重。脾臟指數(shù)=脾臟重量(g)/全凈膛重(g)×100%。

1.6 石蠟切片與HE染色

脾臟固定好后，采用常規(guī)技術(shù)制作，切片厚6 μm，HE染色后用于顯微觀察、拍照和測(cè)量。每個(gè)脾臟組織取20 張切片，用正置顯微攝影系統(tǒng)(麥克奧迪BA410)觀察組織結(jié)構(gòu)。

1.7 脾臟抗氧化功能的測(cè)定

脾臟于-80 ℃取出后稱重，加入適量冰生理鹽水，電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿，3 000 rmp/min離心15 min取上清液，分別選用總抗氧化能力(T-AOC)、GSH-Px、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和MDA測(cè)定試劑盒測(cè)定脾臟抗氧化能力。試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.8 脾臟細(xì)胞增殖和凋亡的測(cè)定

脾臟于-80 ℃取出后，按照RNA提取試劑盒(天根，DP431)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA提取。總RNA用全自動(dòng)蛋白核酸分析儀檢測(cè)濃度和質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo，K1622)合成cDNA。按照 Green Premix Ex TaqTMKit說(shuō)明書(shū)在Roche Light Cycler 480II進(jìn)行(Basel，Switzerland)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。所用引物引物序列及退火溫度見(jiàn)表1?；虻南鄬?duì)表達(dá)采用2-ΔΔCt的方式進(jìn)行計(jì)算和分析。

表1 凋亡、增殖相關(guān)基因引物序列

1.9 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)和單因素方差分析，不同處理組數(shù)據(jù)之間差異性采用LSD法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示顯著差異。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 脾臟重量與指數(shù)

由表2知，28日齡時(shí)，試驗(yàn)Ⅰ組脾臟重量和指數(shù)與對(duì)照組相比顯著升高31.25%和22.73%(P<0.05)；試驗(yàn)Ⅱ組脾臟指數(shù)與對(duì)照組相比顯著升高18.18%(P<0.05)。56日齡時(shí)，試驗(yàn)Ⅱ組脾臟重量與對(duì)照組相比顯著升高36.76%(P<0.05)。

表2 復(fù)方中草藥對(duì)青腳麻雞脾臟重量與指數(shù)的影響

注：同一行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2 脾臟顯微組織結(jié)構(gòu)觀察

由圖1所示，28日齡時(shí)，對(duì)照組脾臟顯微組織結(jié)構(gòu)正常，白髓和紅髓結(jié)構(gòu)清晰，脾小結(jié)和動(dòng)脈周圍淋巴鞘界限明顯，體積較大(圖1A)。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組脾顯微結(jié)構(gòu)更加清晰，脾小結(jié)增多，體積增大，動(dòng)脈周圍淋巴鞘面積增大(圖1C和1E)；試驗(yàn)Ⅲ組脾小結(jié)較小，脾動(dòng)脈周圍淋巴鞘無(wú)明顯變化(圖1G)。

56日齡時(shí)，對(duì)照組脾臟組織結(jié)構(gòu)清晰，脾中白髓和紅髓分界明顯，脾小結(jié)和脾動(dòng)脈周圍淋巴鞘明顯增大，其內(nèi)淋巴細(xì)胞排列密集(圖1B)。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ和Ⅱ組脾小結(jié)數(shù)量明顯增多，體積有所增大，脾動(dòng)脈周圍淋巴鞘細(xì)胞排列緊密，面積增大，其中試驗(yàn)Ⅱ組明顯增大(圖1D和1F)。Ⅲ組脾小結(jié)和動(dòng)脈中周圍淋巴鞘變化不明顯，但淋巴細(xì)胞排列較為疏松(圖1H)。

A-B：對(duì)照組；C-D：試驗(yàn)Ⅰ組；E-F：試驗(yàn)Ⅱ組；G-H：試驗(yàn)Ⅲ組；A, C, E, G：28 d；B, D, F, H：56 d

2.3 脾臟抗氧化功能

由圖2知，28日齡時(shí)，試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組脾臟MDA含量與對(duì)照組相比顯著降低22.13%和22.40%(P<0.05)。56日齡時(shí)，試驗(yàn)Ⅱ組脾臟MDA含量與對(duì)照組相比顯著降低23.15%(P<0.05)；試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組脾臟GSH-Px含量與對(duì)照組相比顯著升高23.13%和21.76%(P<0.05)。

圖2 復(fù)方中草藥對(duì)青腳麻雞脾臟抗氧化功能的影響

2.4 脾臟增殖和凋亡

由圖3可知，28日齡時(shí)，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組脾臟PCNA mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比顯著升高10.32%和14.91%(P<0.05)。56日齡時(shí)，試驗(yàn)Ⅱ組脾臟PCNA mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比顯著升高22.31%(P<0.05)；試驗(yàn)Ⅱ組脾臟Caspase-3 mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比顯著降低27.82%(P<0.05)。

圖3 復(fù)方中草藥對(duì)青腳麻雞脾臟增殖凋亡的影響

3 結(jié)論與討論

脾臟含有豐富的免疫活性細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心。脾臟的良好發(fā)育對(duì)提高動(dòng)物的免疫功能有著重要的作用，而器官的重量和指數(shù)以及顯微組織結(jié)構(gòu)變化能夠在很大程度上反映器官的生長(zhǎng)發(fā)育狀況。金光明等[6]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加黃芪、板藍(lán)根、炒白術(shù)等組成的復(fù)方中草藥能夠明顯促進(jìn)脾臟的發(fā)育，使脾組織結(jié)構(gòu)中紅髓與白髓結(jié)構(gòu)更加清晰，脾小結(jié)明顯增大。郭劍英等[7]研究報(bào)道，飼料中添加1.0%和1.5%由生黃芪、當(dāng)歸、山楂等組成的復(fù)方中草藥能顯著提高小鼠脾臟指數(shù)，促進(jìn)脾臟的發(fā)育。本研究也顯示，日糧中添加1.0%的復(fù)方中草藥能顯著提高腳麻雞28 d脾臟指數(shù)和56 d脾臟重量，改善脾臟組織結(jié)構(gòu)。添加0.5%的復(fù)方中草藥也能顯著提高28 d青腳麻雞脾臟重量和指數(shù)。這表明日糧中添加0.5%和1.0%的復(fù)方中草藥均能促進(jìn)脾臟發(fā)育，這與前人的研究結(jié)果一致，其原因可能是中草藥中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能促進(jìn)機(jī)體的消化吸收，進(jìn)而為脾臟的生長(zhǎng)發(fā)育提供充足的營(yíng)養(yǎng)。

動(dòng)物機(jī)體的快速生長(zhǎng)發(fā)育和較高的營(yíng)養(yǎng)代謝會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生大量的自由基。這些自由基可使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷，使細(xì)胞功能紊亂[8]。其中，GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶，能夠特異性催化GSH產(chǎn)生GSSG，還原過(guò)氧化物，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整；T-SOD是生物體內(nèi)清除自由基的首要活性物質(zhì)，其活力對(duì)機(jī)體氧化與抗氧化平衡起至關(guān)重要作用；MDA是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，是常用的細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化檢測(cè)指標(biāo)，其含量可以反映器官細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化程度，間接反映細(xì)胞損傷情況；T-AOC是動(dòng)物體內(nèi)主要的抗氧化能力檢測(cè)指標(biāo)，其活性可以反映機(jī)體抗氧化作用強(qiáng)弱及各抗氧化體系之間協(xié)調(diào)情況[9]。因此，通過(guò)檢測(cè)器官中MDA含量可以反映器官過(guò)氧化情況，檢測(cè)GSH-Px、SOD和T-AOC含量或活性可反映器官的抗氧化功能[10]。顯示，許多中草藥能夠顯著提高動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力。相關(guān)研究表明，飼料中添加1.0%黃芪、枸杞、金銀花等組成的復(fù)方中草藥能顯著提高胸肌T-AOC和GSH-Px活性，并降低胸肌和腿肌MDA含量，提高胸肌和腿肌的抗氧化能力[11-13]；王翠菊等[11]研究顯示，飼料中添加適量的黃芪多糖可以顯著提高蛋雞血清中SOD和GSH-Px活性，降低血清中MDA含量，進(jìn)而提高機(jī)體抗氧化能力[14]。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，日糧中添加1.0%復(fù)方中草藥可顯著提高56 d青腳麻雞脾臟GSH-Px含量，顯著降低28 d和56 d脾臟MDA含量；添加1.5%的復(fù)方中草藥也能顯著提高56 d脾臟GSH-Px含量，顯著降低28 d脾臟MDA含量。這表明日糧中添加1.0%和1.5%的復(fù)方中草藥均能顯著提高脾臟抗氧化能力。分析其主要原因，可能是由于本研究所用復(fù)方中草藥中所含的多糖成分能夠增強(qiáng)脾臟中抗氧化酶的活性，減少氧自由基的數(shù)量，從而提高脾臟的抗氧化能力。這與徐小芳等[15]研究的結(jié)果一致，中草藥多糖能夠顯著提高雞血清中SOD、GSH-Px、CAT、GR活性，降低MDA含量，提高機(jī)體抗氧化能力。本試驗(yàn)中草藥中還含有總黃酮等活性物質(zhì)，其中隋洪玉等研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英總黃酮還可提高衰老小鼠腦組織內(nèi)SOD活性，降低MDA含量，抑制神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而抑制自由基對(duì)其自身的損害[16]。

細(xì)胞的增殖和凋亡是調(diào)控細(xì)胞正常生命活動(dòng)的兩個(gè)重要細(xì)胞內(nèi)事件，許多體內(nèi)外因素均可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)增殖或凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖或凋亡及其最終命運(yùn)[17]。脾臟淋巴細(xì)胞的增值和凋亡對(duì)其組織結(jié)構(gòu)及免疫功能可產(chǎn)生重要的作用。細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)又稱周期素，是DNA聚合酶δ的一種輔助蛋白，其與細(xì)胞的DNA合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起著關(guān)鍵作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)[18]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中執(zhí)行最終凋亡的最主要分子，其表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞凋亡的過(guò)程可產(chǎn)生重要作用[19]。同時(shí)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，許多中草藥及提取物均能促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。賀旭等[20]研究表明，通過(guò)向大鼠頸總動(dòng)脈灌注三七總皂苷，使Bcl-2和Bax陽(yáng)性細(xì)胞和蛋白水平的比值增加，同時(shí)減低Caspase-3表達(dá)，從而使減少大鼠全腦缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)量。趙盛云等[21]研究顯示，由黨參、白術(shù)、茯苓、甘草制成的煎劑灌胃大鼠，能夠抑制脾虛證模型大鼠胃粘膜細(xì)胞Caspase-3表達(dá)，進(jìn)而減少胃黏膜疾病的發(fā)生。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，日糧中添加1.0%的復(fù)方中草藥可明顯促進(jìn)28 d和56 d脾臟PCNA mRNA的表達(dá)，抑制56 d脾臟Caspase-3 mRNA的表達(dá)；添加0.5%的復(fù)方中草藥能顯著提高28 d脾臟PCNA mRNA的表達(dá)。這說(shuō)明日糧中添加不同劑量的復(fù)方中草藥能不同程度的促進(jìn)脾臟細(xì)胞增殖，抑制脾臟細(xì)胞凋亡。其原因可能是由于本復(fù)方中草藥成分中的甘草，甘草具有抗損傷、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用，同時(shí)Zhou等[22]研究發(fā)現(xiàn)甘草提取物能顯著降低大鼠海馬區(qū)細(xì)胞Bax/Bcl-2蛋白比率、Caspase-3和Cyt-C蛋白的表達(dá)，保護(hù)大鼠海馬神經(jīng)元免受損傷。

綜上所述。日糧中添加1.0%的復(fù)方中草藥對(duì)青腳麻雞脾臟發(fā)育、抗氧化功能和細(xì)胞增殖具有顯著促進(jìn)和增強(qiáng)作用，對(duì)細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用。