王文斌,于歡，楊燕新，邱相坡

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學 文理學院，山西 太谷 030801)

海藻糖(trehalose)是天然雙糖中最穩(wěn)定的糖類且具有非還原性，由α-1,1-糖苷鍵連接2個吡喃環(huán)葡萄糖分子組成，廣泛存在于生物界中，可取代水分子與生物膜及蛋白質等生物大分子的羥基連接維持其結構和功能的穩(wěn)定,在抗逆反應中對生物體有至關重要的保護作用[1]。海藻糖在植物體內(nèi)的合成是基于UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖在海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)的催化作用下合成6-磷酸海藻糖(trehalose-6-phosphate, Tre6P)，再由海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(trehalose-6-phosphate phosphatase, TPP)催化合成海藻糖[2]。然而在植物體內(nèi)合成海藻糖時，由于細胞內(nèi)存在許多可以催化Tre6P脫磷酸化轉化為海藻糖的非特異性磷酸酯酶，可以不經(jīng)過TPP直接催化Tre6P脫磷酸化生成海藻糖，由此可見，TPS蛋白在植物海藻糖合成中具有無法替代的作用，而指導編碼TPS蛋白的TPS基因是否可被成功轉錄表達，對植物體內(nèi)海藻糖的合成具有決定性作用[3]。

自1992年Kassen等人克隆出原核生物大腸桿菌的otsA和otsB基因，被鑒定具有TPS和TPP催化活性后[4]，真核生物TPS基因也相繼被克隆。酵母中與海藻糖合成相關的海藻糖合成酶復合物主要由TPS1、TPS2、TPS3和TSL1四個亞基組成，分別由不同的基因編碼[5]；在高等植物中,首次在擬南芥中發(fā)現(xiàn)具有海藻糖-6-磷酸合成酶功能的TPS基因其被并命名為AtTPS1[6]，擬南芥中存在11個TPS基因，AtTPS1-AtTPS4屬于Ⅰ亞家族，AtTPS5-AtTPS11屬于Ⅱ亞家族，現(xiàn)僅有AtTPS1已被證實具有TPS活性，其它基因功能有待進一步研究[7]；玉米(Maize)9個TPS基因家族中，TPS1和TPS3編碼的蛋白具有TPS活性[8]；水稻(Oryzasaliva)中發(fā)現(xiàn)了11個TPS基因，只有OsTPS1被鑒定具有TPS酶活性[9]；辣椒(Capsicumannuum)中發(fā)現(xiàn)11個TPS基因，其中CaTPS1具有TPS活性，不同組織中TPS表達水平不同，不同逆境下TPS在不同組織中表達水平不同尤其是低溫條件下[10]。由此可見，植物中TPS基因大都以基因家族的形式存在，且只有TPS1被鑒定出具有TPS活性。

甘薯(Ipomoeasebatatas)是中國第四大糧食作物，其具有高產(chǎn)，適應性廣，抗逆性強，利用價值高等特點，且可補中活血、益氣生津，潤腸通便，被譽為“抗癌之王”。目前，關于甘薯TPS基因克隆鮮有報道，本研究基于從干旱脅迫的甘薯葉片轉錄組數(shù)據(jù)庫中得到一條與AtTPS1基因高度同源的Unigene序列，對其進行全長克隆，進行了初步的生物信息學分析，并通過酵母互補實驗鑒定了IbTPS1具有TPS活性，可用于植物抗逆性的分子育種改良。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘薯Xu18由本課題組提供，種植于溫室。野生酵母菌株W303-1A(Mata leu2-3/112,ura3-1,trp1-1,his3-11/15,ade2-1,can1-100, GAL SUC2)、TPS基因完全刪除的單突變體菌株YSH290(W303-1A,tps1Δ::TRP1)和TPS、TPP基因完全刪除的雙突變體菌株YSH567(W303-1A,tps1Δ::TRP1,tps2Δ::LE U2)均由比利時Katholieke Universiteit Leuven植物學與微生物學研究所Filip Rolland教授惠贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘薯IbTPS1基因的克隆

取新鮮的甘薯葉片，用Trizol法提取分離RNA，用反轉錄法合成cDNA。基于甘薯轉錄組中與AtTPS1(GenBank登錄號為NC_003070.9)高度同源的Unigene序列，利用Premier5.0軟件設計RT-PCR引物，其上游引物為ATGCCGGGGAACATGTATAA下游引物為TCATCCTAATGTGAGTGAGT，以cDNA為模板。反應體系為：cDNA模板1.0 μL、上下游引物(20 μmol·L-1)各1.0 μL、10×GC緩沖液2.5 μL、dNTPs(10 mmol·L-1) 2.0 μL、Taq酶0.125 μL、ddH2O補足25 μL。反應程序為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min；56 ℃ 30 s；72 ℃ 3 min；35個循環(huán)，72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(Sangon Biotech,上海)切膠純化回收，與pMD19-T載體連接轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，在含羧芐青霉素(carbenicillin)的LB固體平板上篩選陽性單克隆，菌落PCR鑒定后提取質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.2.2IbTPS1基因序列的生物信息學預測

將克隆得到的IbTPS1基因序列全長使用NCBI中的Blast軟件進行同源性比對分析、ORF Finder軟件查找開放閱讀框及所編碼氨基酸序列和Conserved Domain軟件分析氨基酸序列保守結構域；運用Prot Param pI/Mw、GORIV軟件預測IbTPS1基因序列的一、二級結構；利用ProtScal和SignalP4.1Server預測IbTPS1氨基酸序列的疏/親水性和有無信號肽；利用WoLFPSORT軟件對IbTPS1蛋白質序列進行亞細胞定位預測。

1.2.3 酵母功能互補

采用無縫克隆的方法，根據(jù)載體PYX212的序列設計與載體末端具有15 bp同源序列的特異性引物其上游引物為ACGCGTCGACCCGGGATGCCGGGGAACATGTATAA，下游引物為ATACGGATACCC GGGTCCTAATGTGAGTGAGTATG，以甘薯DNA序列為模板進行PCR擴增，得到產(chǎn)物與用SmaⅠ單酶切后的線性化載體PYX212進行連接轉化，分別構建IbTPS1和ScTPS1基因真核生物表達載體。pYX212表達載體主要包括HXT7P(啟動子)，2*HA(標簽)和URA3(合成尿嘧啶的篩選標記基因)3部分。將2種真核生物表達載體轉入感受態(tài)細胞中，在含氨芐青霉素抗性的LB固體平板上篩選陽性單克隆，經(jīng)菌落PCR及測序鑒定后搖菌提取質粒。

將質粒PYX212/IbTPS1、陽性對照質粒PYX212/ScTPS1和陰性對照空載體PYX212用EZ-Yeast Transformation Kit Cat#2100-200試劑盒轉化缺失突變菌株YSH290和YSH567，在以2%半乳糖為碳源的尿嘧啶缺失培養(yǎng)基上篩選。在以cDNA為模板作陽性對照條件下，挑選陽性單克隆搖菌活化后提取酵母DNA，用相同特異引物擴增IbTPS1基因序列。驗證轉化成功后分別取含有質粒PYX212/IbTPS1、陽性對照質粒PYX212/ScTPS1和陰性對照空載體PYX212的酵母菌液和WT酵母菌液培養(yǎng)至OD600=1，倍比稀釋10-1～10-5后分別接種于含半乳糖的YPGA培養(yǎng)基(1%酵母粉、2%蛋白胨、2%半乳糖、1.5%瓊脂, pH6.25)和葡萄糖的YPDA培養(yǎng)基(1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、1.5%瓊脂pH6.25)上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，驗證轉化的甘薯TPS1酶基因IbTPS1能否恢復酵母突變菌株tps1Δ和tps1Δtps2Δ的生長缺陷。為了分析生長狀況，將細胞稀釋至OD600為0.05，在30 ℃，200 r·min-1恒定培養(yǎng)3 d，并且每30 min測量OD600并分析其生長狀況。

2 結果與分析

2.1 甘薯IbTPS1基因的克隆

以甘薯葉片cDNA為模板，運用反轉錄法獲得大小為2 811 bp的單一電泳條帶如圖1所示，該擴增產(chǎn)物測序后得到序列如圖2所示，根據(jù)NCBI ORF Finder分析發(fā)現(xiàn)IbTPS1編碼一個含936個氨基酸的蛋白。

圖1 甘薯IbTPS1基因的RT-PCR擴增Fig.1 RT-PCR amplification of IbTPS1M: DNA marker 10.0 kb; 1: RT-PCR產(chǎn)物M: DNA marker 10.0 kb; 1: RT-PCR product

2.2 IbTPS1基因序列的生物信息學分析

2.2.1IbTPS1基因編碼氨基酸一級結構預測

ExPASy-ProtScale軟件預測顯示，基因編碼蛋白的分子式C4727H7416N1344O1413S31,理論分子量為106 676.90 Da，等電點為6.51,負電荷殘基(Asp+Glu)為117，正電荷殘基(Arg+Lys)有110個，不穩(wěn)定系數(shù)(II)為45.74，平均疏水性(GRAVY)為-0.376，脂肪系數(shù)(AI)為84.72，是一個不穩(wěn)定蛋白(圖2)。

2.2.2 IbTPS1蛋白二級結構預測

由GORIV軟件預測IbTPS1蛋白主要由3種常見的蛋白質二級結構組成：無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈，其中無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈依次為431個、368個、137個，所占的比例依次為46.05%、39.32%和14.64%，該預測結果表明IbTPS1蛋白無規(guī)則卷曲最多，缺少β-螺旋結構。

2.2.3 IbTPS1蛋白親水性/疏水性預測

ProtScale軟件預測分析發(fā)現(xiàn)結果如圖3所示，在IbTPS1基因的編碼氨基酸序列中，大多數(shù)氨基酸殘基有親水性。第390位具有最低值為-3.333，親水性最強；少數(shù)殘基有疏水性；第399位具有最高值為2.378，疏水性最強。表明該基因編碼蛋白親水性強，是一個親水性蛋白。

2.2.4 IbTPS1蛋白信號肽預測與分析

SignalP3.Server預測結果顯示(表1)，第33位絲氨酸殘基可能是IbTPS1編碼蛋白的信號肽原始剪切位點，其最高預測分值及最高信號肽分值分別僅為0.080和0.106均表明IbTPS1蛋白沒有信號肽。

圖2 甘薯IbTPS1基因的cDNA序列及其推導的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide acid sequence and deduced amino acid sequence of sweetpotato IbTPS1 gene

圖3 甘薯IbTPS1蛋白親/疏水性Fig.3 Pro-/hydrophobicity IbTPS1 protein

2.2.5 IbTPS1蛋白的亞細胞定位預測

Psort軟件預測結果表明，IbTPS1蛋白最有可能定位于細胞質 (45.0%)，其次是葉綠體基質和葉綠體類囊體膜(10.0%)，而被定位在微體上的可能性最小，僅為7.9%。

2.2.6 IbTPS1蛋白的保守結構域分析

IbTPS1氨基酸序列保守結構域如圖4所示，IbTPS1含有GT1-TPS結構域位于271個殘基到1 668個殘基之間，屬于GTB型的糖基轉移酶超家族，還包括一個HAD-TPP結構域位于第1 864個殘基到2 412個殘基之間，屬于鹵代酸脫鹵酶樣(HAD)水解酶類。

表1甘薯IbTPS1蛋白信號肽預測

Table1SingnalP-NNpredictionforsugarcaneIbTPS1protein

項目Item位點Site分值Score隔斷Cut off有無信號肽Signal peptidemax.C330.0800.32NOmax.Y330.0410.33NOmax.S80.1060.87NOmeanS1-320.0370.48NOD1-320.0390.43NO

注：Max.C:原始剪切位點的最大分值; Max.S:信號肽的最大分值; Max.Y:綜合剪切位點的最大分值。D:S-mean和Y-max的加權平均值。

Note：Max.C: scores of putative cleavage site; Max.S: scores of signal peptide; Max.Y: scores of synthesis cleavage site. D: a weighted average of the S-mean and the Y-max scores.

圖4 甘薯IbTPS1蛋白的保守結構域分析Fig.4 Conserved domain prediction of IbTPS1 protein

2.3 酵母功能互補

通過酵母互補試驗來鑒定IbTPS1的TPS活性。由圖5和圖6固體培養(yǎng)基生長結果可知,WT在缺失尿嘧啶的半乳糖和葡萄糖培養(yǎng)基上均不能生長，因其自身不能合成尿嘧啶，且沒有合成尿嘧啶的外源質粒的轉入故不能生長。成功轉化載體的PYX212/IbTPS1、陽性對照PYX212/ScTPS1和陰性對照PYX212均可在缺失尿嘧啶的半乳糖培養(yǎng)基上生長，因其有合成尿嘧啶的外源質粒PYX212，故自身可合成尿嘧啶以半乳糖為碳源正常生長。能在缺失尿嘧啶的半乳糖培養(yǎng)基上生長只能證明載體成功轉化進酵母突變體中，并不能證明目的基因具有TPS活性，因此要在尿嘧啶缺失的葡萄糖培養(yǎng)基上進一步驗證其功能。

圖6 甘薯IbTPS1對酵母雙突變體tps1Δtps2Δ的互補分析Fig.6 Complementation assay of sweetpotato IbTPS1 with yeast double mutant tps1Δtps2Δ

陰性對照空載體PYX212不能在缺失尿嘧啶的葡萄糖培養(yǎng)基上生長，因其自身不具有恢復酵母突變菌株TPS酶基因且也未轉入含有TPS酶活性的外源基因，因此不能利用葡萄糖碳源故不能生長，而陽性對照PYX212/ScTPS1和PYX212/IbTPS1因其具有恢復酵母突變菌株TPS酶活性的外源基因IbTPS1和ScTPS1，可以利用葡萄糖為碳源正常進行糖酵解途徑，正常生長。另外由于空載體PYX212上不含有TPS基因，故不能在缺失尿嘧啶的葡萄糖培養(yǎng)基上生長。雙突變體tps1Δtps2Δ中PYX212/IbTPS1在菌液稀釋至10-1、10-2、10-3時均正常生長而在單突變體tps1Δ中僅在菌液稀釋至10-1時有菌落生長。在液體培養(yǎng)基的生長狀況與固體培養(yǎng)基生長情況基本一致，由測定的菌液濃度OD600值可知tps1Δtps2Δ中菌液濃度普遍高于tps1Δ中菌液濃度PYX212/IbTPS1尤為顯著。

3 討論

海藻糖是一種具有儲存性的碳水化合物，在植物逆境細胞中具有重要的滲透調節(jié)功能。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖與甘露糖、海藻糖等結構中都存在很多羥基，可替代水分子與植物細胞膜上的磷脂頭部結合產(chǎn)生氫鍵，使生物膜結構更加穩(wěn)固不易發(fā)生膜離子滲透，這就是典型的“水替代假說”[11]。在干旱、低溫、高鹽等脅迫條件下，海藻糖可與質膜磷脂吸水性頭部結合形成氫鍵，起到保護及穩(wěn)定蛋白質和細胞膜的作用，在基因工程中，可以通過提高細胞中海藻糖的積累量的方法而增強植物抗逆能力[12]。TPS作為植物海藻糖合成途徑的關鍵酶，將TPS基因直接導入水稻等多種植物中已成功獲得了抗逆能力明顯提高的基因工程植物，而現(xiàn)有轉入外源TPS基因的植物研究中，大都以大腸桿菌或酵母菌TPS基因為目的基因，克隆來源更加安全的TPS基因顯得尤為重要[3]。因此本研究通過RT-PCR技術擴增獲得甘薯TPS1基因cDNA序列，生物信息學分析得知其包含GT1-TPS和TPP兩種氨基酸序列保守結構域，是一個不穩(wěn)定蛋白；無信號肽存在，最可能定位于細胞質中，這與香蕉[13]和墊狀卷柏[14]關于TPS1基因序列分析結果完全一致。實驗酵母互補試驗結果表明IbTPS1基因轉化的酵母突變體tps1Δ和酵母雙突變體tps1Δtps2Δ，在缺失尿嘧啶的以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上可恢復生長，證實IbTPS1編碼蛋白具有TPS酶活。在僅有葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上酵母突變體菌株不能正常生長，主要是因為葡萄糖進入糖酵解途徑中引起ATP的消耗是由己糖激酶介導，酶本身以及Tre6P對己糖激酶活性均有抑制作用，從而無法分解葡萄糖則糖酵解途徑?jīng)]有可利用的碳源，生長受抑制；而半乳糖進入糖酵解途徑是由半乳糖激酶(galactokinase)介導，其活性不受Tre6P的調控，糖酵解過程仍是正常的[15]，因此可以根據(jù)轉化外源基因后的轉化子能否在葡萄糖的培養(yǎng)基上生長來判斷外源基因是否具有TPS酶功能。并且結果顯示無論在固體培養(yǎng)基還是液體培養(yǎng)基上，tps1Δtps2Δ中酵母的生長狀況均明顯優(yōu)于tps1Δ中，因為tps1Δtps2Δ中缺少分解Tre6P特異性TPP酶，只能依靠細胞內(nèi)非特異性磷酸酯酶分解Tre6P，效果甚微，則含有TPS基因的菌株可大量積累Tre6P，具有比對照tps1Δ中的相應菌株更高水平的Tre6P，對己糖激酶活性限制加強，在葡萄糖培養(yǎng)基上生長更好，由此可見雙突變體的互補測定TPS活性比單突變體更靈敏，即使TPS的活性較低微量的Tre6P相對于單突變體來講雙突變體中更易被檢測到[16]。在酵母tps2Δ中沒有進行互補測定，其沒有TPP活性，因為植物TPSI類蛋白的TPP結構域缺少結合和水解Tre6P所必需的殘基[17]，并且以前試驗證實I類TPS蛋白不能互補酵母tps2Δ[18]，因此證明IbTPS1基因具有編碼TPS酶活性，屬于TPSⅠ類蛋白，在Jiang等關于甘薯TPS基因的報道中，與鹽脅迫相關的TPS基因屬于TPSⅡ類蛋白[19]。本試驗結果與水稻[20]、墊狀卷柏[21]和玉米[8]酵母互補試驗結果相一致，不同物種的TPS1基因均可在以葡萄糖為唯一碳源的缺失培養(yǎng)基上恢復生長，但本試驗特色之處在于運用酵母雙突變體(tps1Δtps2Δ)使試驗結果更具說服力，在植物抗逆轉基因品種培育中具有很好的應用與發(fā)展前景。

另外在Van Dijck等[22]的試驗研究中，在復活卷柏和擬南芥中TPS的N-末端序列對其催化活性有明顯抑制作用，將序列N端截斷后轉化入酵母突變菌株后檢測TPS酶活和海藻糖含量，發(fā)現(xiàn)其活性比截斷前提高10倍，海藻糖含量提高20倍[23]。因此在后續(xù)試驗中，將嘗試對IbTPS1基因N-端進行截斷改造，研究其轉基因植物抗逆性。

4 結論

本研究從甘薯轉錄組數(shù)據(jù)庫中得到一條與擬南AtTPS1基因高度同源的Unigene序列并設計特異性引物，運用RT-PCR技術克隆得到IbTPS1基因，其全長為2 811 bp，編碼936個氨基酸，生物信息學分析得知IbTPS1包含GT1-TPS和TPP兩種氨基酸序列保守結構域，是一個不穩(wěn)定蛋白，無信號肽，亞細胞定位于細胞質中，酵母互補實驗結果表明含IbTPS1的酵母突變體tps1Δ和雙突變體tps1Δtps2Δ在以葡萄糖為唯一碳源的尿嘧啶缺失培養(yǎng)基上可恢復正常生長，進一步證實IbTPS1編碼蛋白具有TPS酶活，可為植物抗逆轉基因技術研究和遺傳育種改良提供優(yōu)良的外源基因。