李敏，王青，陳晨，付藝杰，石太瑞

(1.太原師范學(xué)院 生物系，山西 晉中 030619；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

溫帶臭蟲(Cimexlectularius)屬于半翅目(Hemiptera)臭蟲科(Cimicidae)臭蟲屬(Cimex)，是一種以吸食人類血液為生的昆蟲。因其唾液中含有抗凝劑，能夠刺激受害者皮膚，引起發(fā)紅、瘙癢，影響人類睡眠，還傳播某些疾病，如回歸熱、鼠疫等[1]。溫帶臭蟲在我國各地均有分布，近年來溫帶臭蟲咬人事件呈上升趨勢，尤其以珠江三角洲等地區(qū)最為嚴(yán)重，其發(fā)生的場所包括工廠宿舍、出租房、軍營等[2～4]。自20世紀(jì)90年代以來，鐵路旅客被臭蟲叮咬的事件經(jīng)常發(fā)生，迄今為止報(bào)道的列車干線已有6條[5]。近日筆者在山西省臨汾市某酒店和忻州市某學(xué)校也發(fā)現(xiàn)溫帶臭蟲。因此，研究溫帶臭蟲的遺傳多樣性、種群遺傳結(jié)構(gòu)和歷史動(dòng)態(tài)對(duì)其預(yù)測、預(yù)防和防治具有重要意義。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已成為物種遺傳多性性研究的重要手段之一。微衛(wèi)星，也稱簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat, SSR)，是以1～6個(gè)核苷酸堿基(bp)為重復(fù)單位組成的5～40個(gè)的簡單串聯(lián)重復(fù)序列[6]。微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)因其數(shù)量多、多態(tài)性信息豐富、易于檢測、呈共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)成為系統(tǒng)進(jìn)化、群體遺傳學(xué)、保護(hù)遺傳學(xué)以及遺傳育種等研究的有力工具，在植物、動(dòng)物、微生物及人類醫(yī)學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[7～9]。以往的SSR發(fā)掘方法較為繁瑣，需要多個(gè)步驟，花費(fèi)大量的財(cái)力和時(shí)間。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，可以快速精確地從轉(zhuǎn)錄組序列中發(fā)掘出物種中的SSR位點(diǎn)。單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)指同一物種的不同個(gè)體在基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，通常只有頻率大于1%時(shí)才被稱為SNP，占已知多態(tài)性的80%以上。多倍體物種中的SNPs大致可分為simple SNPs、hemi-SNPs和homoeo-SNPs[10]。SNP標(biāo)記作為目前最具發(fā)展?jié)摿Φ姆肿訕?biāo)記，在基因組中具有遺傳穩(wěn)定、數(shù)量多、分布廣且易于檢測等特點(diǎn)，適合于數(shù)量龐大的檢測分析，也是研究遺傳多樣性的主要分子標(biāo)記之一[11,12]。

本研究擬利用軟件msatcommander v0.8.2[13]和SOAPsnp v1.03[14]對(duì)溫帶臭蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR和SNP位點(diǎn)分析，以期為溫帶臭蟲及近緣種的SSR標(biāo)記和SNP標(biāo)記的開發(fā)提供生物信息學(xué)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究其遺傳多樣性、種群遺傳結(jié)構(gòu)和歷史動(dòng)態(tài)乃至對(duì)臭蟲的預(yù)測防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲取

溫帶臭蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及其全基因組數(shù)據(jù)均來自美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)，在genome數(shù)據(jù)庫中的ID為11279。該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和全基因組數(shù)據(jù)分別包含25 468和41 503個(gè)unigene，平均長度均大于200 bp，可以用于溫帶臭蟲SSR與SNP的發(fā)掘。

1.2 溫帶臭蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中SSR與SNP位點(diǎn)的發(fā)掘

SSR位點(diǎn)的發(fā)掘是使用msatcommander v0.8.2 軟件對(duì)獲得的溫帶臭蟲全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，核苷酸重復(fù)次數(shù)分為單核苷酸重復(fù)、二核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)、五核苷酸重復(fù)、六核苷酸重復(fù)，重復(fù)次數(shù)分別為12、6、5、4、4、4。最終得到的符合標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸重復(fù)在本次實(shí)驗(yàn)中定義為SSR。

SNP的發(fā)掘是以溫帶臭蟲全基因組作為參考基因組，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為測序數(shù)據(jù)，使用SOAPaligner/soap2軟件進(jìn)行比對(duì)。將得到的SOAP比對(duì)結(jié)果進(jìn)行排序，排序后的SOAP比對(duì)結(jié)果輸入到SOAPsnp v1.03進(jìn)行預(yù)測，最終得到的結(jié)果為SNP。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫帶臭蟲轉(zhuǎn)錄組SSR數(shù)量及分布特征

溫帶臭蟲轉(zhuǎn)錄組序列經(jīng)過msatcommander v0.8.2軟件的分析后，共得到了4 758個(gè)SSR，占總轉(zhuǎn)錄組序列的18.68%，即出現(xiàn)頻率。這4 758個(gè)SSR分布于4 171條序列中，占總序列的16.38%，即發(fā)生頻率。所發(fā)現(xiàn)的SSR長度在12～45個(gè)堿基之間變化。從溫帶臭蟲轉(zhuǎn)錄組中發(fā)掘出的6種核苷酸重復(fù)中，單核苷酸重復(fù)次數(shù)最多，占總SSR數(shù)量的58.74%，其次是三核苷酸重復(fù)，其數(shù)量少于單核苷酸重復(fù)，占總SSR個(gè)數(shù)的20.68%。六核苷酸重復(fù)的次數(shù)最少，只有2個(gè)，僅占總數(shù)的0.04%，并且每種核苷酸重復(fù)在重復(fù)次數(shù)上存在一定的差異(表1)。例如，單核苷酸重復(fù)一般出現(xiàn)12～14次，二核苷酸重復(fù)則較多地出現(xiàn)，為6～7次，三核苷酸重復(fù)的重復(fù)次數(shù)主要為5～6次，而四、五、六核苷酸重復(fù)次數(shù)主要為4次。

表1 溫帶臭蟲中開發(fā)的SSR數(shù)量及分布Table 1 The amount and distribution of SSR detected in Cimes lectularius

2.2 溫帶臭蟲SSR重復(fù)基元的種類及分布特征

在溫帶臭蟲轉(zhuǎn)錄組中發(fā)掘出的4 758個(gè)SSR中，共有30種重復(fù)基元，6種核苷酸重復(fù)基元的種類數(shù)量分別為2、3、10、12、2、1。 在單核苷酸重復(fù)中，出現(xiàn)最多的是A/T，共出現(xiàn)2 757次，占總數(shù)的57.94%，出現(xiàn)頻率為10.825%。二核苷酸重復(fù)中，出現(xiàn)最多的基元為AT/AT，出現(xiàn)了474次，是總數(shù)的9.96%，出現(xiàn)頻率為1.861%。其次為AG/CT，是總數(shù)的4.17%。三核苷酸重復(fù)出現(xiàn)最多的為ATT/AAT，占總數(shù)的7.91%。四核苷酸重復(fù)、五核苷酸重復(fù)、六核苷酸重復(fù)出現(xiàn)的次數(shù)較少，共占總數(shù)的4.5%(表2)。

2.3 溫帶臭蟲SNP特征分析

用SOAPsnp v1.03對(duì)溫帶臭蟲轉(zhuǎn)錄組25 468條Unigene預(yù)測得到109 301個(gè)SNP位點(diǎn)，每條unigene平均含4.29 個(gè)SNP 位點(diǎn)。其中simple SNPs與hemi-SNPs分別為76 562個(gè)和32 739個(gè)。simple SNPs中轉(zhuǎn)換型46 634個(gè)，占60.91%，顛換型29 928個(gè)，占39.09%。6 種單核苷酸變異中，C/T和A/G發(fā)生的頻率最高，分別為30.69%和30.22%。其它4種單核苷酸變異中A/T、C/G、A/C和 G/T的發(fā)生頻率分別為13.41%、9.57%、8.65%和7.46%(表3)。

3 討論與結(jié)論

通過轉(zhuǎn)錄組測序的方法，本研究在溫帶臭蟲中發(fā)掘出4 758個(gè)SSR位點(diǎn)，出現(xiàn)頻率為18.68%。比已報(bào)道的鞘翅目云南切梢小蠹Tomicusyunnanensis(1.293%)[15]、鱗翅目荔枝蒂蛀蟲Conopomorphasinensis(15.25%)[16]、東方粘蟲Mythimnaseparata(11.505%)[17]、細(xì)梢小卷蛾Rhyacionialeptotubula(3.091%)[18]，雙翅目桔小實(shí)蠅(4.232%)[19]、半翅目蠋蝽Armachinensis(7.60%)[20]、扶桑綿粉蚧Phenacoccussolenopsis(6.334%)[21]等大多數(shù)昆蟲的出現(xiàn)頻率都要高，一定程度上說明溫帶臭蟲SSR標(biāo)記數(shù)量的豐富，較高多態(tài)性潛能，但是跟纓翅目西花薊馬(18.954%)[22]的出現(xiàn)頻率高的物種相比則要低，出現(xiàn)這種頻率差異的原因可能與物種的特異性、測序數(shù)據(jù)量大小和搜索序列標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。

溫帶臭蟲微衛(wèi)星種類較為豐富，其中單核苷酸重復(fù)出現(xiàn)的次數(shù)最多，這與報(bào)道的荔枝蒂蛀蟲[16]、西花薊馬[22]、玉米粘蟲[23]結(jié)果相似。然而，印度谷螟[24]則以二核苷酸重復(fù)最多，與此同時(shí)，云南切梢小蠹[15]、桔小實(shí)蠅[19]、阿麥葉蜂Dolerusaeneus[25]、二點(diǎn)委夜蛾Athetislepigone[26]、褐飛虱Nilaparvatalugens[27]以及灰飛虱Laodelphaxstriatellus[28]則是以三核苷酸重復(fù)最豐富，可見各物種間的SSR類型仍存在著明顯差異[29]。

溫帶臭蟲的重復(fù)基元主要分布在單、二、三核苷酸重復(fù)，占總SSR的95.48%，單核苷酸重復(fù)的主要重復(fù)基元A/T，與當(dāng)前發(fā)掘的大多數(shù)昆蟲的單核苷酸重復(fù)相同。與印度谷螟相似，溫帶臭蟲的二核苷酸重復(fù)以AT/AT為主，但與以AC/GT為主的西花薊馬的重復(fù)基元不同。二核苷酸重復(fù)中的GC/GC基元沒有在溫帶臭蟲上出現(xiàn)，這跟以往研究的大部分昆蟲中GC/GC的含量非常低甚至沒有相一致；與之相反，在鱗翅目玉米粘蟲、二點(diǎn)委夜蛾和細(xì)梢小卷蛾中GC/GC基元，不僅常見而且所占比例較高，因此需要進(jìn)一步研究來確定此重復(fù)基元的具體功能。三核苷酸重復(fù)基元溫帶臭蟲的ATT/AAT占優(yōu)勢，而玉米粘蟲和印度谷螟以CCG/CGG為優(yōu)勢重復(fù)基元。

表2 SSR重復(fù)基元分布特征Table 2 The distribution characteristics of the motifs in Cimex lectularius

對(duì)溫帶臭蟲SNP類型分析發(fā)現(xiàn)，simple SNPs

表3 溫帶臭蟲轉(zhuǎn)錄組中SNPs 位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)Table 3 The statistics of SNP sites in Cimex lectularius

中轉(zhuǎn)換類型占總數(shù)的60.91%(46 634個(gè))，顛換類型占總數(shù)的39.09%(29 928個(gè))，顛換類型明顯少于轉(zhuǎn)換類型。在轉(zhuǎn)換類型中，C-T的發(fā)生頻率非常高，這可能是由于在CG序列上SNP的發(fā)生頻率最高，而胞嘧啶(C)通常以甲基化的形式存在，且脫氧之后就變成胸腺嘧啶(T)[30]，這與錢荷英等人在家蠶的SNP發(fā)掘過程中得到的結(jié)論基本一致[31]。

本試驗(yàn)基于溫帶臭蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)掘出大量SSR和SNP位點(diǎn)，并進(jìn)行了特征分析，研究結(jié)果將為溫帶臭蟲的分子標(biāo)記開發(fā)提供寶貴資源，對(duì)溫帶臭蟲的遺傳多樣性、遺傳圖譜構(gòu)建、功能基因組學(xué)以及制定合理的檢測及預(yù)防措施等研究奠定了基礎(chǔ)。