刁秀楠，斛如媛，高春艷，張永坡，王敏，杜維俊，趙晉忠*，岳愛(ài)琴*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院 山西 太谷 030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

大豆皂苷是大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)中一類重要的次生代謝產(chǎn)物[1]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要的生物功能，可引起植物的防御反應(yīng)，使植物對(duì)病原菌、病毒和害蟲(chóng)等產(chǎn)生抗性[2～4]。大豆皂苷對(duì)人體也具有多種有益的生理功能，如抑制腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)、抗脂質(zhì)氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化以及通過(guò)促進(jìn)甲狀腺激素的分泌保護(hù)肝臟[5～8]。同時(shí)在工業(yè)生產(chǎn)中具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，可開(kāi)發(fā)成發(fā)泡劑、乳化劑和穩(wěn)定劑[9，10]。

大豆皂苷是三萜烯類化合物，主要由甲羥戊酸(MVA)途徑合成。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)是甲羥戊酸途徑上游的第一個(gè)關(guān)鍵酶，不可逆的催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-COA)生成MVA，是大豆皂苷合成途徑的重要調(diào)控位點(diǎn)之一[11，12]。目前已從擬南芥[13]、水稻[14]、甜瓜[15]、歐榛[16]、長(zhǎng)春花[17]、紅豆杉[18]、丹參[19]、人參[20]、積雪草[21]、苦楝樹(shù)[22]等多種植物中分離克隆出相應(yīng)的HMGR基因。HMGR基因在植物中以基因家族形式存在，具有個(gè)數(shù)不等的同源基因。如：擬南芥中含有2個(gè)[13]，橡膠樹(shù)中存在5個(gè)[23]，雷蒙德氏棉基因組中鑒定出9個(gè)[24]。同一植物中HMGR家族成員之間表達(dá)模式有差異，對(duì)MVA途徑中碳流的調(diào)控具有重要作用[19,25]。

目前對(duì)于大豆HMGR基因家族在大豆皂苷合成途徑中的調(diào)控機(jī)制的研究較少，因此，本研究通過(guò)對(duì)大豆HMGR基因家族進(jìn)行鑒定、生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式分析，為今后深入研究大豆皂苷的合成及大豆品質(zhì)改良提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 大豆幼苗的培養(yǎng)

挑選籽粒飽滿的武鄉(xiāng)小黑豆種子，均勻的置于育苗盤中，蓋兩層濕潤(rùn)紗布，避光25 ℃發(fā)芽培養(yǎng)。選取胚軸3 cm左右且長(zhǎng)勢(shì)相同的發(fā)芽種子，將其轉(zhuǎn)移至蛭石的營(yíng)養(yǎng)缽中，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽中點(diǎn)播3粒，培養(yǎng)條件為25 ℃，光照16 h，黑暗8 h。待培養(yǎng)15 d長(zhǎng)至三葉期后，取大豆幼苗根、莖、葉不同組織，立刻置于液氮速凍，在-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 不同發(fā)育時(shí)期大豆籽粒的取樣

2016年將武鄉(xiāng)小黑豆種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站。開(kāi)花期對(duì)開(kāi)花同一時(shí)間且在同一部位的花進(jìn)行掛牌標(biāo)記，分別在開(kāi)花后25、32、40、50、60、70 d取大豆莢，立即剝?nèi)∽蚜Ｓ谝旱賰?，生物學(xué)重復(fù)3次，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1GmHMGR基因家族的鑒定及生物信息學(xué)分析

利用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)、HMMER3.0、PFAM和SMART軟件搜索鑒定大豆基因組中的HMGR基因家族成員。利用ProtParam(http://web.expasy. org/protparam/)預(yù)測(cè)其理化性質(zhì)，SOPMA(http://bip.weizmann.ac.il/bio tools /faq.html)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。利用Clustalw程序?qū)mHMGR基因編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，用MEGA 5.0軟件利用鄰接法(Neighbor-Joining algorithm)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。MEME(http://meme suite. org/)分析保守結(jié)構(gòu)域，GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析基因結(jié)構(gòu)，MG2C2.0(http://mg2c.iask.in/mg 2c_v2.0/)進(jìn)行染色體定位。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成

按照TRIzol?Ls Reagent試劑盒(Ambion，Invitrogen)說(shuō)明書提取大豆材料總RNA，采用Eppendorf核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)樣品RNA質(zhì)量及濃度，利用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(全式金)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一條鏈。

1.2.3GmHMGR基因家族的表達(dá)模式分析

利用Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，采用TransStart?Tip Green qPCR SuperMix(全式金)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。根據(jù)GmHMGR1～GmHMGR8基因的序列差異，利用Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)每個(gè)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異引物，CYP2基因?yàn)閮?nèi)參基因(表1)。反應(yīng)體系：2×TransStart?Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物各0.4 μL(10 μM)，cDNA模板 2 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，GraphPad prism 6.01軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及繪圖。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異引物序列Table 1 Primer sequences used in qPCR analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 GmHMGR基因家族的鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中HMGR基因家族的保守結(jié)構(gòu)域(編號(hào)PF00368)，利用HMMER3.0軟件在大豆基因組中進(jìn)行搜索，PFAM和SMART軟件進(jìn)一步確認(rèn)，鑒定得到8個(gè)GmHMGR基因家族的成員。為了后續(xù)便于分析，將其以GmHMGR1～GmHMGR8的方式進(jìn)行命名(表1)。

對(duì)本研究獲得的 8個(gè)大豆及文獻(xiàn)報(bào)道的 5 個(gè)巴西橡膠樹(shù)[23]和9 個(gè)雷蒙德氏棉[24]的共 23個(gè) HMGR蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果如圖1。發(fā)現(xiàn)所有23個(gè)HMGR成員可以被清晰分成 4 組：ClassⅠ、ClassⅡ、ClassⅢ和 ClassⅣ，每組中都含有大豆HMGR成員。其中，GmHMGR6和7在ClassⅠ中，在雷蒙德氏棉中找到與其配對(duì)的同源序列，GmHMGR1、3和4在ClassⅡ中，與巴西橡膠樹(shù)有同源序列，GmHMGR5和8在ClassⅢ中，在雷蒙德氏棉和巴西橡膠樹(shù)中均能找到與其配對(duì)的同源序列，GmHMGR2單獨(dú)在 ClassⅣ中，未找到其余物種中與其配對(duì)的同源序列。

2.2 GmHMGR基因家族編碼蛋白的理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)

對(duì)GmHMGR蛋白家族進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)各成員之間存在差異(表2)。結(jié)果顯示GmHMGR5編碼蛋白最長(zhǎng)為608個(gè)氨基酸，GmHMGR2最短僅有80個(gè)氨基酸，其余5個(gè)GmHMGR蛋白在543～593個(gè)氨基酸之間。GmHMGR5分子質(zhì)量最大，為64.96 kD，GmHMGR2最小僅有8.23 kD，其余GmHMGR蛋白分子質(zhì)量54.49～63.29 kD。 GmHMGR1和3理論等電點(diǎn)最大均為8.24，GmHMGR2理論等電點(diǎn)最小為4.89。 由表2可知GmHMGR2不穩(wěn)定系數(shù)為36.06，是穩(wěn)定蛋白，其余GmHMGR蛋白不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，為不穩(wěn)定蛋白。GmHMGR蛋白親水性均大于0，為疏水性蛋白。

GmHMGR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的分布比重各不相同(表2)。結(jié)果表明，GmHMGR蛋白由α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲4種結(jié)構(gòu)組成，其中α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲分別大于35.00%和30.92%，所占比重較大。

2.3 GmHMGR基因家族的基因結(jié)構(gòu)分析

對(duì)GmHMGR 蛋白序列進(jìn)一步進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果如圖2 A。發(fā)現(xiàn)這些蛋白可以被清晰的聚為4組，與圖1的分組結(jié)果基本一致，只是不同組間的進(jìn)化關(guān)系略有不同。對(duì)GmHMGR的CDS序列和對(duì)應(yīng)基因序列進(jìn)行內(nèi)含子和外顯子的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖2B。發(fā)現(xiàn)進(jìn)化樹(shù)中聚類在同一支的GmHMGR基因通常具有類似的基因結(jié)構(gòu)。GmHMGR2具有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，其它GmHMGR基因均含有4個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子，相應(yīng)的外顯子長(zhǎng)度大致相同，只是內(nèi)含子長(zhǎng)度相差較大。

2.4 GmHMGR基因家族的保守結(jié)構(gòu)域分析

對(duì)GmHMGR基因家族氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示GmHMGR蛋白含有5個(gè)保守元件(圖2C、2D)。GmHMGR2蛋白只含有保守元件1，其余GmHMGR蛋白均有5個(gè)保守元件，且位置非常保守。GmHMGR蛋白的元件1和元件2分別含有NADP(H)結(jié)合基序(GTVGGGT和DAMGMNM)，元件3中含有2個(gè)HMG-CoA結(jié)合基序(EMPI/VGY/FQI/LP和TTEGCLVA)。

圖1 GmHMGR基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of GmHMGR gene family

基因名稱Gene name基因IDGene ID長(zhǎng)度/aaLength分子量/kDMW等電點(diǎn)PI不穩(wěn)定系數(shù)Instability index親水性平均值GRAVY二級(jí)結(jié)構(gòu)/%Secondary structureα螺旋Alpha helix 延伸鏈Extended strand β轉(zhuǎn)角Beta turn無(wú)規(guī)則卷曲Random coilGmHMGR1XM_003517069.454358.438.2447.500.1043.0917.865.8933.15GmHMGR2XM_014775260.2808.234.8936.060.4335.0026.255.0033.75GmHMGR3XM_003537651.355559.428.2447.920.0941.8017.126.1334.95GmHMGR4XM_003534178.459363.297.9244.130.0643.5116.196.0734.23GmHMGR5XM_006605513.360864.965.7848.350.1543.0917.938.0630.92GmHMGR6XM_003547838.458762.646.8342.510.0743.9516.876.1333.05GmHMGR7XM_003519426.455654.496.4744.100.1241.1917.997.3733.45GmHMGR8XM_003545508.456560.246.1851.020.1143.7217.176.9032.21

注：1.不穩(wěn)定系數(shù)大于40，為不穩(wěn)定蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白。2. 親水性平均值為-2至2，負(fù)值為親水性蛋白，正值為疏水性蛋白。

Note: 1. The instability index is greater than 40, which is unstable protein; the instability index is less than 40, which is a stable protein.2. The average hydrophilicity is -2 to 2, the negative value is hydrophilic protein, and the positive value is hydrophobic protein.

圖2 GmHMGR基因家族的基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Gene structure and protein conservative domain analysis of GmHMGR gene familyA:GmHMGR基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；B:GmHMGR基因家族的基因結(jié)構(gòu)；C:GmHMGR基因家族的保守結(jié)構(gòu)元件分布；D:GmHMGR基因家族的保守結(jié)構(gòu)域。A: Phylogenetic tree of GmHMGR gene family; B: Gene structure of GmHMGR gene family; C: Distribution of conserved structural elements of GmHMGR gene family;D: Conservative domain of GmHMGR gene family.

2.5 GmHMGR基因家族的染色體定位分析

根據(jù)GmHMGR基因在染色體上的位置信息，繪制GmHMGR基因家族染色體分布圖，結(jié)果如圖3。GmHMGR基因分布于8條染色體，GmHMGR1～GmHMGR8分別位于1、2、4、11、9、20、16、2、14號(hào)染色體上。

圖3 GmHMGR基因家族的染色體定位分析Fig.3 Chromosome localization analysis of GmHMGR gene family

2.6 GmHMGR基因家族表達(dá)模式的分析

2.6.1GmHMGR基因家族不同組織表達(dá)模式的分析

對(duì)8個(gè)GmHMGR基因家族成員在武鄉(xiāng)小黑豆苗期根、莖、葉不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4。8個(gè)GmHMGR基因在根、莖、葉中均表達(dá)，且存在組織特異性。其中，相對(duì)其他成員GmHMGR2和GmHMGR5基因在苗期不同組織中表達(dá)量較低，GmHMGR6在根、莖、葉中表達(dá)量較高。GmHMGR基因家族成員在同一組織中的表達(dá)存在差異，GmHMGR1、GmHMGR3、GmHMGR4、GmHMGR5和GmHMGR6基因在葉中的表達(dá)量相對(duì)高于其他組織，而GmHMGR2、GmHMGR7和GmHMGR8則在莖中的表達(dá)量相對(duì)較高。

圖4 GmHMGR基因家族在苗期不同組織中的表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of GmHMGR gene family in different tissues at seedling stage*表示差異顯著(P<0.05)。*show significant difference at the 0.05 level.

2.6.2GmHMGR基因家族籽粒發(fā)育過(guò)程表達(dá)模式分析

對(duì)GmHMGR基因家族成員在武鄉(xiāng)小黑豆不同發(fā)育時(shí)期籽粒中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5。結(jié)果顯示8個(gè)GmHMGR基因在不同發(fā)育時(shí)期籽粒中均能檢測(cè)到表達(dá)，且具有不同的時(shí)空表達(dá)特性。GmHMGR1、GmHMGR2、GmHMGR3、GmHMGR5、GmHMGR7和GmHMGR8基因表達(dá)趨勢(shì)一致，開(kāi)花后40 d表達(dá)量最高，隨后開(kāi)始下降。GmHMGR4和GmHMGR6不同發(fā)育時(shí)期的籽粒的表達(dá)量呈現(xiàn)先增加后減少，再增加的趨勢(shì)，GmHMGR4開(kāi)花后70 d的籽粒表達(dá)量最高，GmHMGR6則在開(kāi)花后32 d的籽粒表達(dá)量較高。在籽粒發(fā)育過(guò)程中，相對(duì)于GmHMGR基因家族的其它基因，開(kāi)花后40 d的籽粒中GmHMGR3的表達(dá)水平最高，但開(kāi)花后70 d的成熟籽粒中則是GmHMGR6的表達(dá)水平最高。

圖5 GmHMGR基因家族在不同發(fā)育時(shí)期籽粒中的表達(dá)分析Fig.5 Expression analysis of GmHMGR gene family in seeds at different developmental stages*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。* show significant difference at the 0.05 level, **show extremely significant difference at the 0.01 level.

3 討論與結(jié)論

通過(guò)在大豆全基因組的同源搜索，共鑒定出8個(gè)大豆HMGR基因，結(jié)果表明HMGR基因在大豆中是以基因家族形式存在的，這與其他植物中的研究結(jié)果一致[13～24]。大豆HMGR蛋白理化性質(zhì)分析表明，GmHMGR基因編碼80～608個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量介于8.23～64.96 kD，理論等電點(diǎn)變化為4.89～8.24，除GmHMGR2為穩(wěn)定疏水蛋白外，其余GmHMGR蛋白均為不穩(wěn)定疏水蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，GmHMGR蛋白的α螺旋為35.00%～43.95%，延伸鏈為16.87%～26.25%，β轉(zhuǎn)角為5.00%～8.06%，無(wú)規(guī)則卷曲為30.92%～34.95%，α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是最豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，這與Liao等[18]對(duì)紅豆杉的HMGR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析中，α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲比重分別為42.45%和40.77%的研究結(jié)果相一致。

本研究通過(guò)對(duì)GmHMGR基因家族進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化和基因結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)除GmHMGR2基因具有1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子，其余GmHMGR基因均具有3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子，且進(jìn)化分析中分為一組的GmHMGR基因的內(nèi)含子及外顯子長(zhǎng)度類似，表明同屬一組的GmHMGR基因可能具有更加相似的功能。對(duì)GmHMGR蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GmHMGR2只具有1個(gè)保守元件，其它基因則具有5個(gè)保守元件，且在基因中的位置高度保守。Darabi等[26]研究表明，在禾本科作物HMGR蛋白質(zhì)的催化結(jié)構(gòu)域中，存在4個(gè)極其保守的基序，2個(gè)HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)(EMPIGYQIP和TTEGCLVA)和2個(gè)NADP(H)結(jié)合位點(diǎn)(GTVGGGT和DAMGMNM)。8個(gè)大豆HMGR蛋白，除GmHMGR2蛋白只具有1個(gè)NADP(H)結(jié)合位點(diǎn)(DAMGMNM)外，其余蛋白均具有4個(gè)保守基序。GmHMGR2的基因結(jié)構(gòu)與編碼蛋白功能結(jié)構(gòu)域與其他成員基因存在較大差異，推測(cè)其可能在其它HMGR基因調(diào)控中具有潛在作用。GmHMGR染色體定位表明，8個(gè)GmHMGR基因分別位于8條不同染色體上，相對(duì)比較分散。本研究對(duì)基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)分析得出的結(jié)果與Li等[27]研究中指出的所有植物HMGR基因家族基因和編碼蛋白的結(jié)構(gòu)高度保守及染色體分布均勻的結(jié)果相一致。

為初步了解大豆HMGR基因的功能，利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)GmHMGR基因家族在武鄉(xiāng)小黑豆根、莖、葉不同組織以及籽粒不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，GmHMGR基因具有多樣化組織和時(shí)空表達(dá)特征。相對(duì)其他成員基因，GmHMGR6基因在苗期根、莖、葉中表達(dá)量最高，籽粒發(fā)育過(guò)程中GmHMGR3在開(kāi)花后40 d的籽粒中表達(dá)水平最高，但開(kāi)花后70 d的成熟大豆籽粒中GmHMGR6的表達(dá)水平最高，因此推測(cè)GmHMGR6可能在大豆苗期根、莖、葉不同組織和成熟籽粒皂苷合成調(diào)控中比其它HMGR基因起著更為重要的作用。GmHMGR基因家族的表達(dá)模式存在差異，這一現(xiàn)象與前人的研究結(jié)果相符[23，24]。羅紅梅等[28]對(duì)人參皂苷合成生物學(xué)關(guān)鍵元件PgHMGR2的研究發(fā)現(xiàn)花中表達(dá)量最高, 其次為葉和根，莖中表達(dá)量最低。Katoemori等[15]研究發(fā)現(xiàn)甜瓜授粉后，果實(shí)生長(zhǎng)初期HMGR表達(dá)量上升，而生長(zhǎng)末期下降。

大豆基因組中含有8個(gè)HMGR基因，具有保守的基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域。所有HMGR基因在苗期根、莖、葉及不同發(fā)育時(shí)期籽粒中均能檢測(cè)到表達(dá)，具有多樣化的組織表達(dá)模式和時(shí)空表達(dá)特征。