唐 儀，唐云云，劉 芳，蘇 堅(jiān),4，夏 紅，曾 希，蘇 琦

(1. 南華大學(xué)腫瘤研究所，湖南省腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省胃癌研究中心，湖南 衡陽 421001；2. 南華大學(xué)附屬湘潭醫(yī)院病理科，湖南 湘潭 411101；3. 永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，湖南 永州 425100；4. 南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科，湖南 衡陽 421001)

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)2018年全世界185個國家統(tǒng)計(jì)的最新報(bào)告，每年新發(fā)病例100萬，死亡78.3萬，發(fā)生率與死亡率分別居于第5位與第3位[1]。我國是胃癌高發(fā)地區(qū)，每年約新發(fā)67.9萬，死亡49.8萬，發(fā)生率與死亡率僅次于肺癌，由于患者就診時大多已發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，常規(guī)手術(shù)和化療效果較差，故5年生存率低[2]。因此，研發(fā)高效低毒藥物與胃癌的早期診斷對提高胃癌的治療效果，延長患者的生存期至關(guān)重要[3]。

二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)作為大蒜中烯丙基硫化物的一種脂溶性的有效成分，對多種腫瘤均有明顯的抑制作用[4]。近年來，microRNAs(miRNAs)在腫瘤中的作用引起人們高度關(guān)注。miRNAs在腫瘤中通過與靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)完全或不完全結(jié)合，表現(xiàn)為癌基因或抑癌基因作用[3]。本研究采用miRNA芯片與qRT-PCR，檢測與鑒定DADS抑制人胃癌MGC803細(xì)胞的差異miRNAs表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌MGC803、BGC823、MKN28、SGC7901、HGC27細(xì)胞，以及正常胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞，由本實(shí)驗(yàn)室保存，置于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑DADS為Fluka公司產(chǎn)品；miRCURYTMArray Power標(biāo)記試劑盒，由上?？党缮锕咎峁籷PCR miRNA試劑盒，購自上海吉瑪公司；RPMI 1640培養(yǎng)液，購自Hyclone公司；胎牛血清，購自四季青生物公司。

1.3 microRNA芯片檢測30 mg·L-1DADS處理24 h的MGC803細(xì)胞與未處理的MGC803細(xì)胞，分別取1×106～1×107細(xì)胞，加1 mL的RNA抽提試劑TRIzol，裂解后抽提RNA，檢測RNA純度及完整性。制備熒光標(biāo)記探針：采用miRCURYTMArray Power標(biāo)記試劑盒，用標(biāo)記酶將Hy3TM或Hy5TM熒光基團(tuán)標(biāo)記miRNA，得到用于與芯片雜交的熒光探針。芯片雜交：在標(biāo)準(zhǔn)條件下，使用PhalanxTM的熱收縮雜交袋，將標(biāo)記號的探針和miRCURYTM芯片雜交。GenePix4000B芯片掃描儀掃描芯片的熒光強(qiáng)度，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)化成數(shù)字型數(shù)據(jù)保存，用配套軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析運(yùn)算。

1.4 qPCR檢測用RNA抽提試劑盒抽提組織與細(xì)胞總RNA，qPCR miRNA試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA存于-80 °C。miR-200b：5′-UAAUACUGCCUG GUAAUGAUGA-3′；miR-22：5′-AAGCUGCCAGUUGA AGAACUGU-3′；所有miRNA序列由美國Exiqon公司合成。采用美國 Illumina公司(Eco)qRT-PCR儀檢測。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×SYBR Mix 10 μL，Taq DNA polymerase 0.2 μL，MiR-PCR primers 0.4 μL，miRNA RT product 2.0 μL，滅菌蒸餾水7.4 μL。上機(jī)：95.0 ℃，3 min；95.0 ℃，12 s；62.0 ℃，35 s；(62.0～95.0) ℃，15 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，軟件自動分析并顯示循環(huán)閾值(CT)和實(shí)時定量熒光動態(tài)曲線。

1.5 臨床胃癌標(biāo)本收集南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院在無任何輔助治療的情況下，手術(shù)中的27例配對的原發(fā)胃癌和鄰近的非胃癌組織。所有組織標(biāo)本HE染色，經(jīng)兩名獨(dú)立病理學(xué)家診斷。所有患者均獲得知情同意書，并經(jīng)華南大學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 DADS作用MGC803細(xì)胞miRNAs差異表達(dá)microRNA芯片檢測顯示，30 mg·L-1DADS處理24 h的MGC803細(xì)胞的差異miRNAs表達(dá)中，發(fā)現(xiàn)7個miRNA上調(diào)，5個miRNA下調(diào)(Fig 1、Tab 1)。

2.2 qRT-PCR檢測上調(diào)miRNAs進(jìn)一步采用qRT-PCR驗(yàn)證上調(diào)miRNAs。Fig 2結(jié)果顯示，30 mg·L-1DADS處理人胃癌MGC803細(xì)胞后，miR-200b、miR-22、miR-7、miR-143、miR-138、miR-34a、miR-150等表達(dá)較未處理組明顯上調(diào)(P<0.05)，與miRNA芯片檢測結(jié)果一致。

2.3 miR-200b與miR-22在人胃癌細(xì)胞表達(dá)根據(jù)DADS處理人胃癌MGC803細(xì)胞后，miR-200b與miR-22上調(diào)最明顯，因此，采用qPCR進(jìn)一步驗(yàn)證miR-200b與miR-22是否在各種人胃癌細(xì)胞表達(dá)上調(diào)。Fig 3檢測結(jié)果顯示，miR-200b與miR-22在MGC-803、BGC-823、MKN-28、SGC-7901、HGC-27等各種人胃癌細(xì)胞表達(dá)較正常人胃癌GES-1細(xì)胞明顯下調(diào)(P<0.05)。

Fig 1 MGC803 cells treated by DADS detected by miRNA chip

Tab 1 The differential expression of miRNAs in MGC803 cells treated by DADS

Fig 2 Up-regulated miRNAs in gastric cancer

*P<0.05vsmock

2.4 miR-200b與miR-22在胃癌組織中表達(dá)為了明確miR-200b與miR-22在胃癌組織的表達(dá)情況，采用qPCR檢測。Fig 4結(jié)果顯示，miR-200b與miR-22在胃癌組織中表達(dá)較正常胃組織明顯下調(diào)(P<0.05)。

Fig 3 Expression of miR-200b and miR-22 in gastric cancer cells detected by

*P<0.05vsGES-1

Fig 4 Expression of miR-200b and miR-22 in gastric cancer detected by

*P<0.05vsnormal

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物白楊黃素具有抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用，白楊黃素可改變miRNAs的表達(dá)，上調(diào)miR-22、miR-34a、let-7a、miR-9、miR-126，下調(diào)miR-21、miR-18a、miR-221，可能是其作用的分子機(jī)制[5]。本研究采用microRNA芯片檢測結(jié)果顯示，DADS處理人胃癌MGC803細(xì)胞的差異miRNAs表達(dá)中，miR-200b、miR-22、miR-7、miR-143、miR-138、miR-34a、miR-150等表達(dá)上調(diào)，而miR-21、miR-222、miR-15b、miR-182、miR-18a等表達(dá)下調(diào)。且qPCR驗(yàn)證7個上調(diào)的miRNA在DADS處理MGC803細(xì)胞較未處理組明顯上調(diào)，與芯片檢測結(jié)果一致。進(jìn)一步檢測上調(diào)最為明顯miR-22與miR-200b在各組胃癌細(xì)胞和組織中表達(dá)明顯下調(diào)。

研究顯示，胃癌組織中miR-22的表達(dá)率較正常組織明顯降低，表明miR-22可能是早期檢測胃癌的良好診斷生物標(biāo)志物[6]。有研究證明，胃癌患者血清中miR-22的水平較健康對照組明顯降低，相反，miR-21的水平明顯高于對照組。生物信息學(xué)分析顯示，Sp1是miR-21靶點(diǎn)，而PTEN是miR-22的靶點(diǎn)，提示其是胃癌潛在的生物標(biāo)志物[3]。幽門螺桿菌感染是慢性炎癥導(dǎo)致胃癌發(fā)生的主要原因，而NLRP3在炎癥發(fā)生過程中起著至關(guān)重要的作用。幽門螺桿菌感染可抑制miR-22的表達(dá)，促進(jìn)NLRP3的表達(dá)，從而引發(fā)了上皮細(xì)胞失控的增殖和胃癌發(fā)生。然而，miR-22可直接靶向NLRP3，在體內(nèi)外降低其致癌作用。因此，miR-22抑制NLRP3并維持胃微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的機(jī)制，可作為胃癌干預(yù)的潛在靶點(diǎn)[7]。我們發(fā)現(xiàn)，miR-22在胃癌中表達(dá)下調(diào)，與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，miR-22可通過靶向metadherin抑制MGC803細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移[8]。DADS可上調(diào)miR-22，通過Wnt-1通路明顯抑制MGC803細(xì)胞增殖與遷移侵襲[9]。

miR-200b是一種在腫瘤進(jìn)展過程中具有多效作用的microRNA與治療靶點(diǎn)。miR-200b通過誘導(dǎo)G2期阻滯和凋亡，抑制食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)細(xì)胞的生長。CDK2和PCNA相關(guān)因子(PCNA-associated factor, PAF)是miR-200b直接的靶點(diǎn)，ESCC中CDK2和PAF水平均較正常組織明顯升高，與miR-200b的頻繁缺失和生存率明顯降低有關(guān)[10]。Zheng等[11]采用薈萃分析1 271例食管癌、3467例胃癌和1517例結(jié)直腸癌患者，鑒定59個miRs，發(fā)現(xiàn)miR-200b與胃腸癌患者預(yù)后不良相關(guān)。在173例胃癌標(biāo)本中，miR-200b低表達(dá)組的預(yù)后明顯低于miR-200b高表達(dá)組，并與腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)。癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)可促進(jìn)miR-200b的表觀遺傳改變，降低miR-200b的表達(dá)，增加胃癌細(xì)胞侵襲和遷移[12]。胃癌組織和正常組織的miRs差異表達(dá)圖譜顯示，miR-200家族在胃癌中表達(dá)下調(diào)，且miR-200家族在癌組織中的表達(dá)明顯低于非癌組織，與組織學(xué)分級和血管內(nèi)侵襲有關(guān)。因此，miR-200家族可能成為胃癌的預(yù)后預(yù)測因子與治療靶點(diǎn)[13]。miR-200b是胃癌、乳腺癌、卵巢癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤的抑制因子。miR-200b在膠質(zhì)瘤組織中下調(diào)與預(yù)后不良相關(guān)，可能是神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物[14]。我們研究顯示，miR-200b在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)與患者臨床分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存率明顯相關(guān)。miR-200b高表達(dá)可直接靶向DNMT3A、DNMT3B和SP1，引起DNMT1、DNMT3A和DNMT3B表達(dá)降低，反過來通過啟動子DNA低甲基化，導(dǎo)致p16、RASS1A1和E-cadherin重新表達(dá)，提示miR-200b可能成為胃癌預(yù)后的標(biāo)志物與治療的靶點(diǎn)[15]。

綜上所述，DADS誘導(dǎo)人胃癌MGC803細(xì)胞的差異miRNAs表達(dá)，有7個miRNA明顯上調(diào)，5個miRNA下調(diào)，DADS可上調(diào)MGC803細(xì)胞miR-200b與miR-22表達(dá)。然而，DADS是否能夠通過上調(diào)miR-7、miR-143、miR-138、miR-34a、miR-150和下調(diào)miR-21、miR-222、miR-15b、miR-182、miR-18a，抑制胃癌細(xì)胞增殖與遷移侵襲，尚待進(jìn)一步研究。