張鑾坤，陳艷芳，劉培慶

(1.中山大學(xué)腫瘤防治中心藥學(xué)部，華南腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，腫瘤醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 廣州 510060；2.廣州醫(yī)學(xué)大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510260；3.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)是衰竭心臟重要的炎癥誘導(dǎo)因子，其可以激活NF-κB通路，并進(jìn)一步誘導(dǎo)TNF-α、白介素2(interleukin 2, IL-2)等炎癥因子的產(chǎn)生，形成正反饋惡性循環(huán)通路。受體相互作用蛋白140(receptor interacting protein 140，RIP140)與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferators-activated receptor γ coactivator 1α，PGC-1α)是轉(zhuǎn)錄調(diào)控輔助因子，在心臟中通過(guò)調(diào)控線粒體能量代謝途徑的關(guān)鍵基因和關(guān)鍵酶的表達(dá)，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞能量代謝平衡。研究表明，心臟中的代謝紊亂狀況與長(zhǎng)時(shí)間低水平的炎癥反應(yīng)息息相關(guān)。高脂飲食的小鼠顯示出心肌胰島素抵抗，并與心臟炎癥、肥厚、纖維化及收縮功能障礙有關(guān)[1]。我們前期的研究表明，大鼠心臟組織中特異性過(guò)表達(dá)RIP140可激活NF-κB通路，并促進(jìn)促炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-2的釋放[2]。Schilling等[3]發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)通過(guò)抑制PGC-1α，調(diào)控心臟能量代謝。Palomer等[4]發(fā)現(xiàn)，TNF-α可降低PGC-1α的表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞葡萄糖氧化。鑒于RIP140與PGC-1α共定位于細(xì)胞核內(nèi)，并有共同轉(zhuǎn)錄輔助調(diào)控的靶基因，起著相反作用，那么TNF-α能否促進(jìn)RIP140的表達(dá)，持續(xù)擴(kuò)大炎癥反應(yīng)與能量代謝紊亂呢？本文通過(guò)研究RIP140與TNF-α對(duì)心肌細(xì)胞的影響，探索心肌細(xì)胞中炎癥反應(yīng)與代謝紊亂之間的交互作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 大鼠心肌細(xì)胞H9c2，購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2試劑 RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Flash SYBR Green qPCR試劑盒(Thermo)；核蛋白提取試劑盒(Active Motif)；TNF-α(Sigma)；p65、IκB-α抗體(Cell Signaling Technology)；Histone H3、α-tubulin抗體(Sigma)；RIP140(Abcam)；TRIzol(TaKaRa)；引物由上海生工合成。

1.1.3儀器 酶標(biāo)儀、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、iQ5熒光定量PCR儀(Bio-Rad)；Image Quantity LAS4000化學(xué)發(fā)光成像儀(通用醫(yī)療)；核酸蛋白微量定量?jī)xNanoDrop 2000、PCR儀(Eppendorf)。

1.2 H9c2細(xì)胞培養(yǎng)從液氮罐中取出冷凍的H9c2細(xì)胞，直接置于37 ℃融化復(fù)蘇，無(wú)菌環(huán)境下轉(zhuǎn)移至含3～4 mL DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS)的15 mL離心管中，1 000 r·min-1離心6 min，棄上清，每管用5～6 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代3次后，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 腺病毒感染H9c2細(xì)胞攜帶RIP140基因的腺病毒(Ad-RIP140)及腺病毒空載對(duì)照(Ad-GFP)由本課題組構(gòu)建，嚴(yán)格按照Clontech 腺病毒純化試劑盒(Adeno-XTM Maxi purification kit)的要求操作，其構(gòu)建和鑒定參考前期研究[5]。H9c2心肌細(xì)胞分別加入重組腺病毒Ad-RIP140及對(duì)照Ad-GFP，直接覆蓋心肌細(xì)胞表面，37 ℃孵箱中培養(yǎng)4 h 后補(bǔ)加適當(dāng)體積的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)感染44 h。

1.4 細(xì)胞核蛋白、胞質(zhì)蛋白提取與Western blot參照核蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，分離細(xì)胞核蛋白和胞質(zhì)蛋白，考馬斯亮藍(lán)蛋白定量后，分裝50 μg蛋白上樣。配制8%的分離膠和5%的濃縮膠，70 V分離30 min，于120 V電壓繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部。220 mA恒流電轉(zhuǎn)90 min，用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入相應(yīng)抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h，洗膜后于暗室下加入生物發(fā)光液顯影。采用化學(xué)發(fā)光成像儀、Quantity one軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，以組蛋白Histone H3、α-tubulin分別作為核蛋白與胞質(zhì)蛋白的內(nèi)參對(duì)照。

1.5 qPCR法檢測(cè)mRNA表達(dá)水平取各組貼壁細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，使用核酸微量定量?jī)x對(duì)提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢查及定量，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得模板cDNA。使用Flash SYBR Green qPCR試劑盒對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，熒光定量PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)，最終以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算目標(biāo)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，引物序列見(jiàn)Tab 1。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒介導(dǎo)RIP140基因在H9c2細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)驗(yàn)證使用純化腺病毒Ad-RIP140感染H9c2細(xì)胞，Western blot檢測(cè)RIP140的蛋白表達(dá)。如Fig 1所示，隨著感染滴度的升高和感染時(shí)間的延長(zhǎng)，H9c2心肌細(xì)胞外源性RIP140的表達(dá)逐漸增加。

Fig 1 Efficacy of Ad-RIP140

RIP140 protein level increased in H9c2 infected with Ad-RIP140 in a quantity-dependent(A) and time-dependent(B) manner.

2.2 TNF-α與RIP140引起心肌細(xì)胞能量代謝紊亂PPARs中的PPAR-α與PPAR-β/δ可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞脂肪酸攝取、β氧化和葡萄糖代謝的多種蛋白。丙酮酸脫氫酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase isoform 4，PDK4)是調(diào)節(jié)丙酮酸氧化脫羧的重要激酶，控制著心肌細(xì)胞葡萄糖分解代謝的速率。為了探索TNF-α與RIP140的相互作用能否影響能量代謝，我們培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，分為對(duì)照組、Ad-RIP140組、TNF-α組、Ad-RIP140+TNF-α組，real-time PCR檢測(cè)PPAR-α、PPAR-β/δ、PDK4的mRNA表達(dá)水平。如Fig 2所示，與對(duì)照組相比，Ad-RIP140組PPAR-α、PPAR-β/δ、PDK4的mRNA表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TNF-α組PPAR-α和PDK4的mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05)；與Ad-RIP140組相比，Ad-RIP140+TNF-α組PPAR-β/δ和PDK4的mRNA表達(dá)水平更低(P<0.05)。說(shuō)明TNF-α與過(guò)表達(dá)RIP140可引起心肌細(xì)胞能量代謝紊亂。

Fig 2 TNF-α aggravated down-regulation of key metabolic genes by superabundant

Cardiomyocytes were infected with Ad-RIP140(MOI 240, 48h), simultaneously with or without TNF-α(100 μg·L-1, 24 h) treatment. The mRNA levels of PPAR-α, PPAR-β/δ, and PDK4 were measured.*P<0.05vsAd-GFP group.#P<0.05vsAd-RIP140 group.

2.3 過(guò)表達(dá)RIP140促進(jìn)H9c2心肌細(xì)胞p65-NF-κB轉(zhuǎn)位入核我們使用純化腺病毒Ad-RIP140感染H9c2心肌細(xì)胞，觀察過(guò)表達(dá)RIP140能否在成年大鼠心肌細(xì)胞模型中激活NF-κB通路。如Fig 3所示，與腺病毒空載Ad-GFP組相比，Ad-RIP140感染組H9c2細(xì)胞核內(nèi)p65含量明顯升高，胞質(zhì)中IκB-α的含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，H9c2心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)RIP140可激活NF-κB通路，p65-NF-κB轉(zhuǎn)位入核。

2.4 過(guò)表達(dá)RIP140促進(jìn)H9c2心肌細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子mRNA表達(dá)炎癥反應(yīng)中，NF-κB調(diào)控著多個(gè)誘導(dǎo)因子和效應(yīng)因子的表達(dá)，我們利用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)了TNF-α、IL-1β、IL-2的mRNA水平，進(jìn)一步觀察炎癥通路激活后炎癥因子的表達(dá)情況。Fig 4結(jié)果顯示，H9c2心肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)RIP140可明顯上調(diào)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)(P<0.05)。

2.5 TNF-α增加心肌細(xì)胞RIP140的表達(dá)TNF-α可降低PGC-1α的表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞葡萄糖氧化。考慮到RIP140與PGC-1α有共同轉(zhuǎn)錄輔助調(diào)控的靶基因，TNF-α對(duì)RIP140的表達(dá)也可能有影響。我們使用TNF-α(20 μg·L-1)刺激H9c2心肌細(xì)胞12 h，觀察到RIP140的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)Fig 5。

Fig 3 Activated NF-κB signaling following RIP140

H9c2 cells were infected with adenovirus overexpressing RIP140(MOI 240, 48 h) or GFP control. Protein levels of p65 in nucleus and IκB-α in cytoplasm were detected.*P<0.05,**P<0.01vsAd-GFP group.

Fig 4 Superabundant RIP140 induced proinflammatory response in H9c2 cell

H9c2 cells were infected with an adenovirus overexpressing RIP140(MOI 240, 48 h) or GFP control. The mRNA levels of TNF-α, IL-1β and IL-2 were measured by real-time PCR.*P<0.05vsAd-GFP group.

3 討論

心臟做功與能量代謝密切聯(lián)系，為維持其收縮與舒張功能，心肌細(xì)胞將貯存在脂肪酸與葡萄糖中的能量轉(zhuǎn)化為肌漿球蛋白的機(jī)械能。PPARs是核激素受體家族中的配體激活受體，它有3個(gè)亞型，其中PPAR-α與PPAR-β/δ在心臟的表達(dá)豐度較高，它們通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸攝取、β氧化和葡萄糖代謝的多種蛋白，對(duì)心臟能量代謝起著重要的調(diào)控作用。在心肌細(xì)胞使用葡萄糖供能的代謝中，丙酮酸在丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(pyruvate dehydrogenase complex，PDC)催化下氧化脫羧，生成乙酰輔酶A。PDK4是調(diào)節(jié)PDC活性的重要激酶，控制著葡萄糖的分解代謝速率。PPAR-α、PPAR-β/δ和PDK4下調(diào)，意味著心臟利用脂肪酸供能減少，利用葡萄糖供能增多，能量供應(yīng)總體降低。前期研究表明，促炎癥細(xì)胞因子與病理性心室重構(gòu)和心衰的形成密切相關(guān)。心衰患者心肌組織血清中的促炎細(xì)胞因子TNF-α含量明顯增加，NF-κB活性也明顯增強(qiáng)。心臟特異性過(guò)表達(dá)TNF-α可引起心肌炎癥反應(yīng)和病理性重構(gòu)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致充血性心力衰竭[6]。此外，NF-κB特異性抑制劑和基因敲除均能明顯抑制壓力負(fù)荷和AngII灌注誘導(dǎo)的心肌肥大[7]。轉(zhuǎn)基因小鼠心臟特異性激活I(lǐng)KK/NF-κB通路，可誘導(dǎo)炎癥性心肌病變及心衰[8]。可見(jiàn)，心肌肥厚、心衰的發(fā)生和發(fā)展伴隨著NF-κB通路的激活及TNF-α等促炎癥細(xì)胞因子的參與。我們前期的研究表明，特異性過(guò)表達(dá)RIP140的大鼠心臟代謝相關(guān)基因明顯下調(diào)，但三磷酸腺苷含量沒(méi)有明顯變化，心臟功能障礙得到了補(bǔ)償；而在梗死手術(shù)的應(yīng)激下，過(guò)表達(dá)RIP140大鼠心臟在線粒體基因、呼吸控制比和ATP含量中表現(xiàn)出更大程度的抑制，心臟整體功能進(jìn)一步惡化[9]。本研究結(jié)果中，TNF-α刺激心肌細(xì)胞導(dǎo)致PPAR-α、PDK4的mRNA表達(dá)水平下降，Ad-RIP140組PPAR-α、PPAR-β/δ、PDK4的mRNA表達(dá)水平下降。Ad-RIP140組、TNF-α組細(xì)胞存活率沒(méi)有變化，Ad-RIP140+TNF-α組出現(xiàn)細(xì)胞部分死亡的情況(約10%～15%)，存活細(xì)胞PPAR-β/δ、PDK4的mRNA表達(dá)水平更低，TNF-α應(yīng)激顯然加劇了RIP140引起的心肌細(xì)胞能量代謝紊亂，與我們前期研究結(jié)果一致。

Fig 5 TNF-α induced RIP140 expression

H9c2 cells were treated with or without TNF-α(20 μg·L-1, 12 h). The mRNA(A) and protein levels(B) of RIP140 were measured by real-time PCR and Western blot.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

在心肌細(xì)胞中，LPS可通過(guò)激活NF-κB通路，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而抑制PPARs則加劇了此效應(yīng)，說(shuō)明抑制PPARs可增加NF-κB的活性[10]。我們前期的研究表明，乳鼠心肌細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)RIP140可通過(guò)激活NF-κB通路，使PPARs的表達(dá)明顯下降，并且PPARs的下降跟NF-κB通路激活相關(guān)[11]?？梢?jiàn)，RIP140可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和能量代謝紊亂，本研究進(jìn)一步使用H9c2成年大鼠心肌細(xì)胞模型，探索RIP140與炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系。腺病毒介導(dǎo)的RIP140過(guò)表達(dá)系統(tǒng)可激活心肌細(xì)胞NF-κB通路，致使細(xì)胞中促炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、TNF-α表達(dá)升高。綜合文獻(xiàn)和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：一方面，過(guò)表達(dá)RIP140可以通過(guò)激活NF-κB通路，下調(diào)PPARs的表達(dá)；另一方面，過(guò)表達(dá)RIP140很可能通過(guò)下調(diào)PPARs的表達(dá)，間接激活NF-κB通路，從而形成炎癥與能量代謝紊亂的惡性循環(huán)。

RIP140與PGC-1α共同調(diào)節(jié)著一系列能量代謝相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄，其作用相反，在心衰的發(fā)展過(guò)程中，RIP140表達(dá)升高，PGC-1α表達(dá)下降[12]。PGC-1α減少或RIP140增加，均引起PDK4的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，導(dǎo)致葡萄糖的分解代謝速率加快。Palomer等[4]發(fā)現(xiàn)，TNF-α可降低PGC-1α的表達(dá)，抑制PDK4的轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)心肌細(xì)胞的糖代謝速率。這與我們給予TNF-α后，心肌細(xì)胞RIP140表達(dá)上調(diào)，且PDK4表達(dá)下降的結(jié)果是一致的。TNF-α對(duì)心肌細(xì)胞能量代謝的影響可能與RIP140表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

綜上所述，一方面，RIP140可激活NF-κB通路，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子白介素、TNF-α表達(dá)升高；另一方面，促炎癥因子TNF-α可刺激RIP140增加，二者作用形成一種正反饋，共同致PPAR-β/δ和PDK4表達(dá)下降加劇，加速心肌細(xì)胞能量代謝紊亂。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)在中山大學(xué)藥學(xué)院藥理毒理實(shí)驗(yàn)室完成。)