倪維晨，李瑞霞，陶啟威，張 戟，畢研飛，錢春桃,4*

(1.南農(nóng)大(常熟)新農(nóng)村發(fā)展研究院有限公司，江蘇 蘇州 215500； 2.常熟市農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇 蘇州 215500； 3.江蘇常熟國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)管理委員會，江蘇 蘇州 215500； 4.南京農(nóng)業(yè)大學，江蘇 南京 210095)

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，鮮食玉米如糯玉米、甜玉米等的遺傳改良及新品種選育工作得到高度重視，新品種不斷涌現(xiàn)，鮮食玉米市場異?；钴S。糯性鮮食小玉米作為常熟地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的特色農(nóng)作物之一，已經(jīng)成為地方農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)升級的品牌產(chǎn)品，在地方特色農(nóng)產(chǎn)品品牌塑造工程的“董浜鄉(xiāng)情十二品”中占據(jù)著重要位置，通過網(wǎng)絡(luò)銷售和鄉(xiāng)村旅游節(jié)銷售推介，已經(jīng)成為常熟市董浜鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)供給側(cè)改革的一個重要抓手。

糯性鮮食小玉米品種自交系常年種植面積在333 hm2以上，具有豐富的優(yōu)異基因資源，但至今還未能系統(tǒng)、科學地進行研究、開發(fā)和保護。DNA分子標記已經(jīng)在一些地方玉米品種、水稻、小麥等[1-2]主要農(nóng)作物的種質(zhì)資源研究中得到廣泛應(yīng)用。鮮食玉米遺傳育種及生產(chǎn)應(yīng)用發(fā)展迅速，但分子標記技術(shù)在種質(zhì)鑒定中的應(yīng)用與普通玉米相比仍顯落后。

簡單序列重復SSR標記是建立在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)之上的一種遺傳標記，相比其他常用技術(shù)具有穩(wěn)定性好、準確性高等優(yōu)點，被廣泛運用于農(nóng)作物品種鑒定及指紋圖譜構(gòu)建中[3]。本研究采用SSR分子標記技術(shù)對常熟地區(qū)10份地方糯性鮮食小玉米品種進行分析，構(gòu)建了10個地方糯性鮮食小玉米品種的指紋圖譜，建立了一套適合常熟地區(qū)鮮食小玉米品種SSR分子標記的分析技術(shù)體系，以期為常熟市鮮食糯性小玉米品種的遺傳資源評價、品種保護提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

常熟市農(nóng)業(yè)科學研究所提供其糯性小玉米自交系10份。糯性小玉米自交系在室內(nèi)用恒溫箱沙床培養(yǎng)，待玉米生長到3葉1心時，隨機取5株同一葉位的葉片混合，放于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。自交系名稱編號見表1。

表1 10份糯性小玉米名稱及編號

1.2 DNA提取

利用DNA快速提取試劑盒(DN15-新型植物基因組DNA快速提取試劑盒，北京艾德萊生物科技有限公司)提取玉米葉片總DNA，利用1%的瓊脂糖凝膠檢測提取的DNA質(zhì)量，挑選條帶亮、清晰的DNA保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR引物篩選

結(jié)合MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/data_center/ssr)數(shù)據(jù)庫和前人對玉米自交系SSR核心引物的研究結(jié)果，篩選出均勻分布于玉米10條染色體上的30對擴增條帶清晰、重復性好、多態(tài)性豐富的引物。引物由南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 標記分析

PCR擴增體系配制在冰上完成，反應(yīng)體積為15 μL，其中包括：10×PCR緩沖液 1.5 μL，5 U·μL-1Taq酶0.225 μL，25 mmol·L-1Mg2+0.9 μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.3 μL，0.01 mmol·L-1引物為0.6 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.875 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性4 min，1個循環(huán)；94 ℃變性1 min，47～60 ℃復性45 s(根據(jù)引物退火溫度調(diào)整)，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，1個循環(huán)；4 ℃保存待檢測。反應(yīng)產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，銀染顯色照相和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

SSR擴增產(chǎn)物以0、1統(tǒng)計建立數(shù)據(jù)庫，在相同位置上，有條帶的記為1，沒有條帶的記為0；以簡單相配系數(shù)計算自交系的遺傳相似值[4]，GS=m/(m+n)，m表示基因型共有帶數(shù)目；n表示基因型間差異帶數(shù)目。利用Ntsys 2.1軟件進行數(shù)據(jù)處理，按UPGMA方法對供試自交系進行聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 糯性小玉米的分子標記

利用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測提取的DNA質(zhì)量，如圖1所示，DNA條帶清晰，較為集中，拖尾不明顯，沒有降解。

圖1 DNA的電泳檢測結(jié)果

2.2 SSR標記檢測結(jié)果

利用30對SSR標記對10個糯性小玉米自交系進行PCR擴增，8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測和銀染顯影分析SSR擴增產(chǎn)物。共篩選到20對SSR引物在所有試驗材料中有多態(tài)性的譜帶，并且條帶較為清晰。圖2為引物P6-P10擴增結(jié)果。

圖2 引物P6-P10的擴增結(jié)果

對篩選的20對出多態(tài)引物條帶進行統(tǒng)計分析。如表2所示，20對引物共檢測到70個等位基因變異，不同位點引物的等位基因變異數(shù)為2～6個，引物P2、P3、P10、P21、P29最少，檢測到2個；引物P6、P7最多，檢測到6個；平均每對引物等位基因變異數(shù)為3.5個。

2.3 引物的確定

評價20對引物在10份糯性小玉米品系間的帶型清晰度、多態(tài)性高低和帶型統(tǒng)計的難易程度，作為最終鑒定的候選引物，再根據(jù)入選引物在每條染色體上均勻分布的原則，最終確定bnlg2291k4、umc1545y2、bnlg161k8、umc1506k12、umc2084w2、umc1536k9、umc1335y5、umc2115k3、umc1489y3、bnlg240k1等10對引物作為鑒定糯性小玉米的鑒定引物。10對引物對10份糯性小玉米品系的檢測結(jié)果表明，10對引物共檢測出39條帶，每對引物檢測2～6條帶，平均3.9條帶，其中bnlg161k8、umc1506k12條帶數(shù)最多為6個。

2.4 DNA數(shù)字指紋建立

以多態(tài)性高、重復性好、帶型易區(qū)分統(tǒng)計的原則確定了10對核心引物，將SSR-PCR擴增產(chǎn)物特征譜帶進行0、1數(shù)字化，建立數(shù)據(jù)庫(表3)。特征條帶大小范圍在140～400 bp，相似性在0.1～0.7(表4)。聚類分析表明，10對引物可以將10份糯性小玉米品系區(qū)分開。根據(jù)趙久然等[5]提出的計算玉米指紋圖譜概率的公式：P=1/N，對自交系N=n，N為自交系數(shù)，n為所用引物的等位基因數(shù)。本文確定的10對核心引物組合可區(qū)分的最大自交系數(shù)N=2×3×6×6×4×2×4×5×3×4=414 720，出現(xiàn)相同指紋圖譜的概率P=2.41×10-6，因此可利用這組引物對構(gòu)建常熟市糯性小玉米的自交系指紋。

表2 20對SSR引物在10個糯性小玉米品系中檢測到的等位基因數(shù)

表3 10份糯性小玉米品系DNA指紋數(shù)據(jù)

表4 10份糯性小玉米品系的遺傳相似系數(shù)

3 討論

種質(zhì)資源是農(nóng)作物新品種選育的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，長期的育種工作實踐證明，一個突破性品種的育成往往來自于一個特異性狀基因的利用[6]。玉米地方品種經(jīng)長期的自然和人工選擇，積累了大量的適應(yīng)當?shù)厣鷳B(tài)條件的優(yōu)良基因，形成了極其豐富多彩的玉米資源類型以及部分具有獨特優(yōu)良性狀的資源材料[7]。因此，對地方玉米種質(zhì)資源的保護和發(fā)掘及推動全國玉米發(fā)展具有重要的意義。

隨著分子標記技術(shù)的快速發(fā)展，分子標記技術(shù)在農(nóng)作物親緣關(guān)系和分類研究、品種的真實性和純度鑒定、新品種指紋圖譜構(gòu)建等方面得到廣泛應(yīng)用，并發(fā)揮著重要的作用[8]。其中，SSR分子標記以多態(tài)性高、重復性好、費用較低等特點，在玉米的指紋圖譜構(gòu)建、品種鑒定等方面應(yīng)用廣泛。盧媛等[9]利用40對玉米SSR核心引物對供試品種進行DNA指紋鑒定，確定滬玉糯3號玉米的真實性，并篩選出6對共顯性SSR核心引物，用于滬玉糯3號玉米的純度鑒定；姚丹青等[3]利用篩選的25對玉米SSR引物，構(gòu)建了上海地區(qū)32個玉米品種的DNA指紋圖譜；邸仕忠等[10]利用SSR分子標記對60種玉米自交系構(gòu)建指紋圖譜，并篩選出10對引物用于玉米自交系的鑒定；呂學高等[11]利用40對玉米SSR核心引物，對浙江省90份玉米地方種質(zhì)資源進行聚類分析，將其分為四大類別。本研究利用20對SSR引物對10份糯性小玉米自交系進行遺傳多樣性分析，共檢測到70個等位變異，平均等位基因變異數(shù)為3.5，等位基因變異范圍是2～6；遺傳相似性在0.1～0.7。本研究的等位基因數(shù)與國內(nèi)玉米相關(guān)研究相近，低于國外研究結(jié)果[12]。出現(xiàn)這種結(jié)果的可能原因是本次試驗選用的是地方糯性小玉米品種，品種范圍較小，種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)相對狹窄。

本研究確定的10對SSR引物作為核心引物構(gòu)建了常熟地區(qū)10份糯性小玉米自交系的指紋圖譜，這10對引物的擴增條帶2～6條，帶型統(tǒng)計簡單易統(tǒng)計，可區(qū)分的最大自交系數(shù)N=4.15×105，出現(xiàn)相同指紋圖譜的概率P=2.41×10-6，檢測10份自交系的DNA指紋圖譜沒有任何兩份材料帶型完全相同。因此，可以利用這10對引物對常熟地區(qū)糯玉米自交系進行鑒定。但篩選出來的10對引物與邸仕忠等[10]、劉濤等[13]、李世風等[14]的研究結(jié)果存在差異，這可能與所處不同地區(qū)、選用不同的玉米材料多態(tài)性存在差異有關(guān)。

本研究利用SSR標記技術(shù)進行指紋圖譜采集，首次構(gòu)建了10份糯性小玉米品種指紋圖譜，為常熟當?shù)赜衩灼贩N快速檢測奠定了基礎(chǔ)，為地方品種管理、品牌形成、農(nóng)民的利益維護提供強有力的技術(shù)支撐，有利于保護地方優(yōu)秀種質(zhì)資源，促進糯性鮮食小玉米研究及市場的健康發(fā)展。