俞立新 陳學(xué)強(qiáng)，2 吳群峰 董衛(wèi)芹 郭松華 于 健 馮 煒 楊 雷傅一峰 李俊杰 羅 程

1 中國人民解放軍第九八醫(yī)院 浙江 湖州 313000

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

3 浙江省杭州市富陽中醫(yī)骨傷醫(yī)院 浙江 杭州 311400

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨密度降低與骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞，骨脆性增加的一種疾病，患者可在日常生活中受輕微外力下引起骨折，是臨床常見病、多發(fā)病。且這一類骨折因患者多為老年人，常合并其他疾病，且骨折多為粉碎性，穩(wěn)定性差，骨折愈合遲緩或不愈合時(shí)有發(fā)生，存在較高的致殘率、致死率[1]。目前有關(guān)其治療主要是通過手術(shù)、手法整復(fù)聯(lián)合抗骨質(zhì)疏松治療，缺少骨質(zhì)疏松骨折患者針對(duì)性治療藥物，而中藥治療骨質(zhì)疏松歷史悠久，療效肯定，許多中藥被證實(shí)既可改善骨質(zhì)疏松同時(shí)還可促進(jìn)骨折愈合。肉蓯蓉屬于常用補(bǔ)腎陽代表藥，具有補(bǔ)益肝腎作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎主骨，骨折治法也多不離補(bǔ)腎益精，現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉還具有一定雌激素樣作用[2]。本研究擬通過骨密度測量、Micro-CT和血清白介素-1β（IL-1β）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）水平觀察并肉蓯蓉水提物對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合的影響并初步探索其內(nèi)在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑器材：體重210～250gSPF級(jí)雌性SD大鼠52只，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。絡(luò)合碘，杭州朗索醫(yī)用消毒劑有限公司，批號(hào)20160720；青霉素，華北制藥股份有限公司，批號(hào)F3117217；IL-1β試劑盒（批號(hào)：20160715）、TGF-β1試劑盒（批號(hào)：20160722）；雙能X線骨密度掃描儀，OSTEOCORE2；Micro-CT，Skyscan1176。

1.2 肉蓯蓉水提液提取：將碾碎肉蓯蓉（浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥廠）10倍超純水浸泡0.5小時(shí)，煎鍋煎煮1.5小時(shí)，重復(fù)提取2次，混合藥液旋蒸儀濃縮至濃度1.5g/ml，存放4℃冰箱備用。

1.3 造模制備：分述如下。

1.3.1 骨質(zhì)疏松模型：大鼠造模前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、治療組，分別16只、18只、18只，每組依2周、6周時(shí)間點(diǎn)各分成兩小組，治療組和模型組均1%戊巴比妥鈉麻醉（0.4ml/100g）后備皮、消毒、鋪巾、切開皮膚后摘除大鼠雙側(cè)卵巢，對(duì)照組僅切開不摘除卵巢。

1.3.2 骨折模型：骨質(zhì)疏松造模后6周后準(zhǔn)備制備骨折模型，各組大鼠麻醉后行股骨中段骨密度測定，完成后取大鼠右側(cè)股骨中段進(jìn)行備皮、消毒、鋪巾、切開，行股骨中段橫行骨折造模[3]，并以1mm克氏針固定，消毒縫合切口皮膚。

1.4 藥物干預(yù)：造模術(shù)后行股骨X線檢測，剔除模型制備失敗大鼠，并在造模后肌注8萬單位青霉素預(yù)防感染。術(shù)后24h治療組開始予肉蓯蓉水提物灌胃（濃度1.5g/ml，1g/kg，每日1次），對(duì)照組與模型組則予同體積生理鹽水灌胃。

1.5 樣本收?。焊深A(yù)后2周、6周后收取大鼠樣本，各組大鼠1%戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動(dòng)脈取血5～10ml制備血清，儲(chǔ)存于-20℃冰箱備用。然后處死大鼠，收取股骨骨折樣本，并置于10%中性甲醛固定72小時(shí)。

1.6 檢測指標(biāo)：分述如下。

1.6.1 骨密度：所有骨質(zhì)疏松造模后大鼠，行骨折造模前均麻醉后行股骨中段骨密度測定。3組大鼠在干預(yù)2周、6周后收取樣本，樣本在固定72小時(shí)后再次行骨密度測定。

1.6.2 Micro-CT：樣本固定72小時(shí)后進(jìn)行Micro-CT掃描，以骨折端上下各200張圖片作為感興趣區(qū)域(ROI)，掃描角度 360°，電流 555uA、電壓 42kV，濾光片 Al 0.2mm，分辨率8.73μm，完成后進(jìn)行骨痂三維圖像重建與分析。檢測參數(shù)如下：骨體積分?jǐn)?shù)BV/TV、骨小梁模式因子(Tb.Pf)；結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)等[4]。

1.6.3 血清IL-1β、TGF-β1測定：從-20℃冰箱解凍各組大鼠血清，分別按照IL-1β和TGF-β1試劑盒說明書逐步進(jìn)行檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS.19進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3組大鼠骨密度、Micro-CT參數(shù)、IL-1β、TGF-β1水平均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組骨密度情況：見表1。

表1 各組大鼠股骨中段骨密度結(jié)果（±s，g/cm2）

表1 各組大鼠股骨中段骨密度結(jié)果（±s，g/cm2）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組比較，△P＜0.05。

6w 0.34±0.02 0.21±0.01△0.27±0.02*△組別對(duì)照組模型組治療組只數(shù)8 9 9 0w 0.34±0.02 0.23±0.03△0.22±0.02△2w 0.34±0.03 0.22±0.02△0.24±0.02*△

2.2 Micro-CT二維截面：矢狀位二維截面選取各組各時(shí)間點(diǎn)股骨縱軸中心截面圖片（見圖1），水平面二維截面圖則選取骨折線下第100圖片進(jìn)行對(duì)比（圖2），從圖中可見各組骨痂隨時(shí)間逐漸增多，但在骨折后6周不同程度塑性；同時(shí)可見對(duì)照組骨痂體積大，6周后骨痂皮質(zhì)厚實(shí)并爬過骨折線，而模型組2周時(shí)骨痂骨質(zhì)較少，6周后骨痂皮質(zhì)稀松，治療組2周時(shí)骨痂體積雖不大，但骨痂中骨質(zhì)較模型組多，6周后骨痂塑形較好且骨折線不明顯。

圖1 各組股骨中段矢狀位截面

圖2 各組股骨中段水平截面

2.3 Micro-CT三維重建：股骨中段骨折端骨痂三維重建見圖3。從圖3可見各組骨折后2周骨痂沿骨折線兩端骨膜形成，但各組骨折線仍然清晰，模型組與治療組尤為明顯，而骨折6周后對(duì)照組骨痂厚實(shí)，多以板狀骨小梁為主，骨折線消失，而模型組骨質(zhì)稀松，骨折線較模糊，但治療組骨痂骨質(zhì)較多，骨小梁規(guī)則且厚實(shí)，骨折線不明顯。

圖3 骨折端ROI骨痂三維重建

2.4 Micro-CT參數(shù)指標(biāo)：運(yùn)用軟件對(duì)骨折端骨痂進(jìn)行分析[4]得到相關(guān)參數(shù)見表2。

表2 各組Micro-CT參數(shù)比較（±s）

表2 各組Micro-CT參數(shù)比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組比較，△P＜0.05。

指標(biāo)BV/TV Tb.Sp Tb.N Tb.Th SMI 6w 52.73±2.64*3.56±0.13*0.24±0.03*△0.27±0.01*△1.62±0.08*對(duì)照組（n=8）2w 30.09±2.46 3.71±0.35 0.33±0.02 0.37±0.01 1.69±0.08 6w 54.46±2.24 3.61±0.22 0.33±0.03 0.37±0.02 1.70±0.08模型組（n=8）2w 32.39±2.23△4.18±0.22△0.16±0.02△0.22±0.02△2.62±0.12△6w 38.31±1.83△4.51±0.18△0.15±0.01△0.21±0.01△2.79±0.10△治療組（n=8）2w 36.54±2.59*3.70±0.21*0.22±0.01*△0.25±0.01*△2.29±0.19*△

2.5 血清IL-1β、TGF-β1水平：見表3。

表3 各組IL-1β、TGF-β1水平比較（±s，n=8）

表3 各組IL-1β、TGF-β1水平比較（±s，n=8）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組比較，△P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組治療組6w 35.65±1.86*28.86±1.70 33.90±2.33*IL-1β 2w 319.25±13.31 333.87±10.35 309.28±6.39*6w 109.46±3.40*168.15±4.83 119.10±3.56*△TGF-β1 2w 130.98±5.87*97.28±6.21 136.96±7.43*

3 討論

近年來，中藥淫羊藿、骨碎補(bǔ)及復(fù)方（青娥丸、六味地黃丸等）在臨床實(shí)踐中被證實(shí)可明顯改善骨質(zhì)疏松癥候[1]，這類中藥及復(fù)方多以補(bǔ)益肝腎為主，這與骨折中后期補(bǔ)腎續(xù)筋原則一致[5]。肉蓯蓉始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，李時(shí)珍曰：“此物補(bǔ)而不峻，故有從容之義”，蓯蓉味甘、咸，性溫，具有補(bǔ)腎壯陽、填精補(bǔ)髓、養(yǎng)血潤燥、悅色延年之功[6]。

本研究中，干預(yù)2周、6周后治療組骨密度均高于模型組（P＜0.05），Micro-CT掃描BV/TV參數(shù)顯示治療組在干預(yù)后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)結(jié)果與骨密度測定結(jié)果一致，而BV/TV是骨質(zhì)疏松性骨折愈合評(píng)估的重要指標(biāo)，直接反映骨痂骨質(zhì)含量，這說明肉蓯蓉可能具有促進(jìn)成骨的作用，分析原因可能與肉蓯蓉中有效成分具有上調(diào)BMP2作用有關(guān)[7]，而BMP2為TGF-β家族中成員之一。并且這一結(jié)果也被Micro-CT掃描其他參數(shù)（Tb.Sp、Tb.N、Tb.Th、SMI）所印證，Tb.Sp、SMI反映的是骨痂生物力學(xué)特性，治療組中數(shù)值明顯優(yōu)于模型組，這也進(jìn)一步提示肉蓯蓉具有改善骨量丟失，促進(jìn)成骨進(jìn)而加快骨折愈合的作用。

在血清IL-1β、TGF-β1水平方面，干預(yù)2周、6周后發(fā)現(xiàn)治療組IL-1β水平2周時(shí)均低于其他兩組，在6周時(shí)，雖然治療組IL-1β水平高于對(duì)照組，但仍明顯低于模型組（P＜0.05）；而治療組TGF-β1水平，在2周、6周時(shí)均高于模型組和對(duì)照組，且與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而IL-1β水平直接影響破骨細(xì)胞的分化與活性，其水平升高將會(huì)促進(jìn)骨吸收，抑制成骨細(xì)胞增殖、分化，但TGF-β1則與骨性干細(xì)胞增殖、分化、遷移密切相關(guān)，具有促進(jìn)軟骨和骨痂形成[2]，加快骨痂塑形的作用，這提示肉蓯蓉改善骨量丟失，促進(jìn)成骨，加快骨折愈合作用可能通過降低骨質(zhì)疏松性骨折大鼠IL-1β水平、抑制破骨細(xì)胞活性實(shí)現(xiàn)；此外可能還與肉蓯蓉可升高骨折大鼠TGF-β1水平，促進(jìn)成骨分化與骨痂成熟塑形有關(guān)。

綜上所述，依據(jù)骨密度、Micro-CT掃描參數(shù)分析及血清IL-1β、TGF-β1水平，發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉水提物可改善骨丟失，促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合，而其機(jī)制可能與其可抑制骨質(zhì)疏松骨折后大鼠血清IL-1β分泌和促進(jìn)TGF-β1分泌，進(jìn)而改善骨質(zhì)疏松、促進(jìn)骨折愈合有關(guān)。