陳 高，劉 彤，萬何平，陳禪友

（江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院；湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430056）

菜豆（Phaseolus vulgarisL.）為豆科菜豆屬菜豆種的植物，又名四季豆、蕓豆［1］。菜豆于16 世紀(jì)末開始在我國引種栽培，在中國的栽培歷史已超過500年，現(xiàn)在在我國各地均有種植［2］，已成為我國主要的蔬菜及糧食作物。菜豆具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值［3］，鮮莢含豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維和糖類，其籽粒鈣含量是黃豆的2 倍多，雞的7 倍多。

菜豆中含有一種可以使血液凝集的蛋白質(zhì)，稱為菜豆凝集素，菜豆凝集素不僅是導(dǎo)致菜豆食用中毒的主要成分之一，同時也是菜豆抵御病蟲害的主要手段之一［4-5］。因?yàn)椴硕鼓貙Σ∠x害有一定的抵御及殺傷作用，其有作為一種生物農(nóng)藥的潛質(zhì)，同時與一般農(nóng)藥不同，只需將其煮沸處理即可使其失活。如果將菜豆凝集素作為生物農(nóng)藥生產(chǎn)，一種可以快速高效生產(chǎn)菜豆凝集素的手段是必不可少的。組織培養(yǎng)技術(shù)作為一種生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物的有效手段［6-7］，可以有效解決菜豆生長周期長、菜豆產(chǎn)量受季節(jié)影響等問題，可以在短期內(nèi)大量而持續(xù)地生產(chǎn)菜豆愈傷組織，為提取菜豆凝集素提供原材料。

本研究以‘Bean Saint esprit a oeil rouge’‘Bean White rice’‘97-5 架豆’為材料，選取其組培苗的莖、葉、子葉作為外植體，進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，并選取長勢較好的愈傷組織進(jìn)行凝集素水平測定，為進(jìn)一步快速高效地生產(chǎn)菜豆凝集素，研制植物源生物農(nóng)藥提供數(shù)據(jù)支持及試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用的 3 個菜豆品種為‘Bean Saint esprit a oeil rouge’‘Bean White rice’‘97-5 架豆’，均由江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院和湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌苗的獲得 菜豆的消毒滅菌參考文獻(xiàn)［8］的方法，略有改動。選擇表面無皺紋、光滑、無損傷且籽粒飽滿的‘Bean Saint esprit a oeil rouge’‘Bean White rice’‘97-5 架豆’菜豆種子各 40 粒分別放入培養(yǎng)瓶中，用自來水洗滌30 s，轉(zhuǎn)移至無菌工作臺操作。用70%酒精振蕩30 s，倒入無菌水洗凈菜豆表面的酒精，加入升汞振蕩8 min，加入無菌水反復(fù)振蕩洗滌5 ～6 次，每次1 ～2 min，加入無菌水浸泡菜豆4 ～6 h，直至菜豆膨脹，表面沒有褶皺。將菜豆接種入MS 培養(yǎng)基［9］，封口放入培養(yǎng)室培養(yǎng)6 ～7 d，培養(yǎng)溫度25 ℃，光照12 h/d。

1.2.2 菜豆外植體（莖、葉、子葉）接種及植物組織培養(yǎng) 在超凈工作臺上將菜豆組培苗的不同外植體（莖、葉、子葉）切成0.5 ～1 cm 的小段，分別轉(zhuǎn)入6 種不同激素配比（見表1）的MS 培養(yǎng)基中，每種菜豆的不同外植體做3 個平行對照組。放入培養(yǎng)室中以培養(yǎng)溫度25 ℃、光照12 h/d 進(jìn)行培養(yǎng)，每隔7 d 觀察并記錄各培養(yǎng)基中各外植體的愈傷組織生成情況。

表1 不同激素配比Tab.1 Hormone formular /（mg·L-1）

1.2.3 菜豆凝集素的含量測定 將生長良好的不同菜豆外植體的愈傷組織取出，稱取5 g，分別在研磨時加入0.2 mol/L pH=7.2 的磷酸鹽緩沖液（PBS）15 mL 磨成（可加入石英砂幫助研磨）水溶液狀，在4 ℃下8 000 r/min 離心20 min，取上清液，4 ℃保存。

檢測凝集素含量使用血凝法［10］，略有改動。用采血管從兔耳中靜脈血管采血，將兔血與Alsever′s液按1∶4 的比例混合，裝入離心管放入冰箱中4 ℃保存。取96 孔V 型凝血板，在每一孔中加入25 μL 0.2 mol/L pH=7.2 的PBS，第一列除外，再在第一、二列加入各品種菜豆的3 種外植體的凝集素溶液25 μL，每種菜豆的各外植體凝集素做3 組對照（一共27 列）。將每行第二列孔內(nèi)溶液混勻，取出25 μL加入每行第三孔，再混勻，取出25 μL 溶液加入第四孔，以此類推，做倍比稀釋，直到最后一孔，取出25 μ L 溶液棄掉。觀察凝集素水平前，先將裝有兔血的離心管放入冷凍離心機(jī)中，在4 ℃下1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，以 1∶3 的比例加入 PBS 緩沖液，反復(fù)數(shù)次至上清液澄清。取10 μL 兔血溶液加入PBS 緩沖液稀釋至1 mL，在顯微鏡下用細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察細(xì)胞數(shù)量，以平均2 × 108個/mL 細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)稀釋兔血溶液。再在V 型凝血板中每格樣品溶液中各加入25 μL 稀釋好的兔血溶液，將凝血板25 ℃下靜置2 h，放在燈光下觀察凝血結(jié)果，并拍照記錄，凝集現(xiàn)象如圖1 所示，計(jì)算凝集活力［11］。凝集活力的計(jì)算公式為：凝集活力（HU）=2n/50，其中n為樣品在凝血板中半凝集時，倍比稀釋的孔數(shù)。

圖1 紅細(xì)胞凝集示意圖Fig.1 Schematic diagram of red blood cell aggregation

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素對子葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表2 可知，在培養(yǎng)1 周后，不同濃度的2，4-D 和KT 含量比例的培養(yǎng)基誘導(dǎo)菜豆子葉愈傷組織生成的差異十分明顯。在加入相同濃度的6-BA 的條件下，保持培養(yǎng)基中KT 濃度相同，增加2，4-D 濃度，可觀察到‘97-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’子葉的愈傷率均明顯上升，而保持培養(yǎng)基2，4-D 濃度相同，增加KT 的濃度，可觀察到3 種菜豆子葉的愈傷率均增長不明顯，所以分析后可知2，4-D 誘導(dǎo)子葉愈傷組織生成的效果優(yōu)于KT。培養(yǎng)2 周后，觀察菜豆子葉愈傷組織的生長情況，可得出使用DBKC2培養(yǎng)基，即使用MS + 3 mg/L 2，4-D + 0.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L KT 激素配比的培養(yǎng)基能使‘97-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’子葉的愈傷率達(dá)到最大。觀察‘97-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的子葉培養(yǎng)基中的子葉外植體，可發(fā)現(xiàn)DBKA1培養(yǎng)基中子葉基本褐化，并基本不生成愈傷組織，隨著培養(yǎng)基中2，4-D、KT 含量增加，可觀察到除了愈傷率增大、有淡黃色的愈傷組織產(chǎn)生以外，子葉的褐化率也隨之降低，可推測若需降低子葉外植體褐化率需加入足夠的 2，4-D 和 KT。因此，可得到‘97-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的適宜子葉愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基是DBKC2，即MS+3 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT。

2.2 不同激素對莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表3 可知，培養(yǎng)1 周后，不同濃度的2，4-D 和KT 含量的培養(yǎng)基在誘導(dǎo)菜豆莖愈傷組織生成的差異不明顯。在加入相同濃度的6-BA 的條件不變的情況下，保持培養(yǎng)基內(nèi)KT 濃度相同，增加2，4-D 濃度，可觀察到‘97-5 架豆’‘Bean White rice’莖愈傷組織的愈傷率有所上升，‘Bean Saint esprit a oeil rouge’愈傷率變化不明顯。保持培養(yǎng)基2，4-D 濃度相同，增加KT 的濃度，可觀察到‘97-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’莖的愈傷率基本無變化。雖然2，4-D、KT 對莖愈傷組織愈傷率影響不大，但激素含量高的培養(yǎng)基所生成的愈傷組織體積更大，結(jié)構(gòu)更加緊密。培養(yǎng)2 周后，可觀察到‘97-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’莖的愈傷率基本都達(dá)到100%，得到比較緊湊且體積較大的乳白色或淡黃色的愈傷組織，且基本沒有出現(xiàn)褐化?？赏茰y出含有不同激素的培養(yǎng)基對莖愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響很小，但2，4-D、KT 含量高能使莖長出更多、更緊密的愈傷組織。因此，可得知‘97-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的適宜莖愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基是DBKC2，即MS + 3 mg/L 2，4-D + 0.5 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L KT。

表2 不同激素對子葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.2 Effect of different hormones on callus induction of cotyledons /%

表3 不同激素對莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.3 Effect of different hormones on callus induction of stem /%

2.3 不同激素對葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表 4 可知，培養(yǎng) 1 周后，不同濃度的 2，4-D 和 KT 含量的培養(yǎng)基在誘導(dǎo)‘97-5 架豆’‘Bean White rice’葉愈傷組織生成的差異不明顯，但在加入相同濃度的6-BA 的條件下，保持培養(yǎng)基中KT 濃度相同，增加2，4-D 濃度，可觀察到‘Bean Saint esprit a oeil rouge’葉的愈傷率明顯上升，而保持培養(yǎng)基2，4-D濃度相同，增加KT 的濃度，可觀察到‘Bean Saint esprit a oeil rouge’葉的愈傷率降低，可推斷2，4-D 對‘Bean Saint esprit a oeil rouge’葉誘導(dǎo)愈傷有促進(jìn)作用，而在2，4-D 含量高的情況下，KT 對‘Bean Saint esprit a oeil rouge’葉誘導(dǎo)愈傷則有抑制作用。培養(yǎng)2 周后，可觀察到‘Bean Saint esprit a oeil rouge’葉的愈傷率基本達(dá)到100%，‘97-5 架豆’‘Bean White rice’的DBKC2培養(yǎng)基中葉的愈傷率基本能達(dá)到80%。可觀察到3 種菜豆葉的愈傷組織呈米黃色或綠色，均未出現(xiàn)褐化現(xiàn)象?！?7-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的適宜葉愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基是DBKC2，即MS + 3 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L KT。

表4 不同激素對葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.4 Effect of different hormones on callus induction of leaf /%

2.4 不同外植體對菜豆愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表2、表3、表4 可知，培養(yǎng) 2 周后，觀察‘97-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的子葉、莖、葉愈傷組織生長狀況，可看出在培養(yǎng)條件相同的情況下，3 種菜豆均為莖愈傷率最高，幾乎都是100%，愈傷組織基本呈綠色或米黃色，少數(shù)為乳白色，愈傷組織的結(jié)構(gòu)飽滿，且基本不會出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。3 個菜豆品種葉的愈傷率較高，愈傷組織呈淡黃色，且基本無褐化現(xiàn)象，但其愈傷組織體積小且結(jié)構(gòu)疏松，其基本只在葉與培養(yǎng)基的接觸面生長。子葉的愈傷率最低，長出的愈傷組織體積小且疏松，呈綠色或白色，少數(shù)呈淡黃色，且子葉褐化率較高，褐化與培養(yǎng)基激素的含量有一定的關(guān)系，褐化比較嚴(yán)重的子葉基本不能誘導(dǎo)出愈傷組織。

2.5 菜豆凝集素水平測定結(jié)果

由表5 可得知，在3 個菜豆品種中，‘Bean Saint esprit a oeil rouge’各個外植體的愈傷組織的凝集活力均最高。而在‘Bean Saint esprit a oeil rouge’3 種外植體中，子葉和葉愈傷組織的凝集活力最高；再結(jié)合表2、表3、表4 觀察，雖然總的來說莖的愈傷組織生長狀態(tài)最好，但是單就適宜激素組合DBKC2來看，‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的3 種外植體第14 天愈傷率均為100%，未見明顯差異；綜合凝集素含量考慮，選取‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的子葉和葉在MS+3 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT 中進(jìn)行植物組織培養(yǎng)可提取較多的菜豆凝集素。

表5 菜豆凝集素水平測定結(jié)果Tab.5 Results of determination of common bean lectin level

3 討論

在愈傷組織培養(yǎng)過程中，添加不同的激素對愈傷組織的誘導(dǎo)效果不同，常見的激素配比多為一種生長素加上一種細(xì)胞分裂素，而本試驗(yàn)中激素配比為一種生長素加上兩種細(xì)胞分裂素。在前期試驗(yàn)中，2，4-D + 6-BA 的激素組合培養(yǎng)出來的菜豆愈傷組織過于緊密，而2，4-D + KT 的激素組合培養(yǎng)出來的菜豆愈傷組織的含水量又太高，因而在本試驗(yàn)中將兩種細(xì)胞分裂素組合起來，得到了結(jié)構(gòu)較為松散且含水量較少的愈傷組織，且部分組合的愈傷率達(dá)到了100%。

在菜豆組織培養(yǎng)中基因型是影響菜豆愈傷誘導(dǎo)效果的重要因素之一。在朱有光等［12］的菜豆的組織培養(yǎng)和植株再生研究中，不同菜豆的愈傷率也不相同，可見不同基因型的菜豆的愈傷誘導(dǎo)效果有差異。本試驗(yàn)中，在‘97-5 架豆’‘Bean White rice’‘Bean Saint esprit a oeil rouge’3 種菜豆中，‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的愈傷率最高，且愈傷組織的體積最大，愈傷生長狀態(tài)最佳，‘97-5 架豆’次之，‘Bean White rice’最差。同時‘Bean Saint esprit a oeil rouge’愈傷組織中的凝集素含量也最高，與前期試驗(yàn)‘Bean Saint esprit a oeil rouge’菜豆豆莢的凝集素含量最高保持一致［13］。但同時，菜豆愈傷組織中的凝集素含量低于菜豆豆莢中的凝集素含量，這可能是由于愈傷組織的生長環(huán)境較為良好，無外來威脅刺激其表達(dá)菜豆凝集素。為提高菜豆愈傷組織的凝集素含量，可在后期研究中向培養(yǎng)基中添加一些菜豆凝集素的前體物質(zhì)，或者一些相關(guān)病蟲害的粉末，刺激菜豆愈傷組織合成更多的菜豆凝集素。

不同外植體的選擇不僅影響菜豆愈傷組織的形成，也對其愈傷組織的凝集素含量有重要影響。包英華等［14］在豇豆再生體系建立的研究中發(fā)現(xiàn)，各外植體在相同培養(yǎng)條件下莖尖的愈傷誘導(dǎo)效果最好，葉次之，與本研究結(jié)果相似。同時，有研究表明［15］菜豆凝集素主要分布在籽粒中，而本研究發(fā)現(xiàn)子葉與葉的愈傷組織凝集素含量較高，可見選取凝集素含量較高的外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得的愈傷組織凝集素含量也較高。

綜上所述，3 個菜豆品種的3 種外植體在MS + 3 mg/L 2，4-D + 0.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L KT 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的愈傷組織愈傷率最高且長勢較好。同時，用‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的子葉與葉作為外植體產(chǎn)生的愈傷組織凝集素含量最高。因此，使用‘Bean Saint esprit a oeil rouge’的子葉或葉為外植體，在MS + 3 mg/L 2，4-D + 0.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L KT 中進(jìn)行培養(yǎng)可獲得較多的菜豆凝集素。本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究菜豆凝集素生物農(nóng)藥提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)支持。