李艷玲,李向輝,趙建平,劉永錄,張遠方,張貴方
(河南牧業(yè)經濟學院,河南 鄭州 450011)
清瘟敗毒散是清代著名溫病學家余師愚所創(chuàng)制的名方[1],由石膏、知母、黃連、黃芩、赤芍、牡丹皮、連翹、梔子等十四味中藥組成,是《中華人民共和國獸藥典》每版均收載的成方制劑[2]。該方主治熱毒發(fā)斑、高熱神昏,臨床廣泛用于多種病原微生物感染引起的畜禽疑難雜癥的治療[3-6]。清瘟敗毒顆粒是在散劑的基礎上改制而來?,F行《中華人民共和國獸藥典》清瘟敗毒散標準,除對部分藥材顯微鑒別外,只對方中的黃連進行了薄層定性鑒別。為建立該顆粒劑的質量標準,有效控制顆粒劑質量,本實驗對制劑中的赤芍、梔子、玄參進行了薄層鑒別。
清瘟敗毒顆粒由河南牧業(yè)經濟學院制藥工程學院提供( 批號20170731) ;梔子苷(批號:110749-200714 ,中國藥品生物制品檢定所);玄參對照藥材(110325-200627,中國藥品生物制品檢定所);赤芍苷(121148-200715,中國藥品生物制品檢定所);石膏、知母、黃芩、赤芍、黃連、牡丹皮、桔梗、連翹、梔子、淡竹葉、地黃、甘草等飲片均購于江蘇、湖北、安徽等地,經河南牧業(yè)經濟學院制藥工程學院趙建平高級獸醫(yī)師檢驗,均符合2015版《中國獸藥典》( 二部) 項下相關要求和規(guī)定。其他試劑均為分析純。
分析天平(上海醫(yī)用激光儀器廠);KQ-200KDE超聲波清洗機(昆山市超聲儀器公司)。
2.1.1 供試品溶液的配制
取清瘟敗毒顆粒樣品8 g,加乙醇100 mL,超聲30 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加水20 mL使溶解,用乙醚洗滌3次,每次15 mL,棄去乙醚液,水液用水飽和正丁醇振搖提取3次,每次20 mL,合并正丁醇液,蒸干,殘渣加乙醇1 mL使溶解。加中性三氧化二鋁0.5 g,水浴上攪勻,干燥,加在中性三氧化二鋁柱上(100-200目,2 g,內徑1-1.5 cm),用甲醇50 mL洗脫,收集洗脫液,蒸干,殘渣加乙醇1 mL使溶解,標記為供試品溶液。
2.1.2 陰性對照液的配制
稱取缺赤芍的清瘟敗毒顆粒8 g,在研缽中研磨成細粉,然后按照供試品溶液的制備方法制成缺赤芍的陰性對照液。
2.1.3 赤芍苷標準品的配制
稱取赤芍苷標準品0.002 g,加2 mL甲醇制成含赤芍苷1 mg/ml的溶液,標記為標準品溶液。
2.1.4 鑒別方法
用毛細管分別吸取供試品溶液、陰性對照液和赤芍苷標準品溶液,分別點在同一硅膠G薄層板的同一直線上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(305100.2)為展開劑,展開,取出,晾干,噴5%香草醛硫酸溶液,105℃加熱至斑點清晰,以檢視赤芍陰性、樣品、赤芍苷標準品。結果見圖1。
圖1 赤芍鑒別薄層圖譜1.清瘟敗毒顆粒(缺赤芍)陰性; 2.清瘟敗毒顆粒樣品; 3.赤芍苷標準品
從圖1可以明顯看出,清瘟敗毒顆粒樣品在與赤芍苷標準品相對應的位置有相同顏色的斑點,而缺赤芍的陰性樣品沒有。說明此方法可以定性鑒別出清瘟敗毒顆粒中的赤芍。
2.2.1 供試品溶液的配制
稱取清瘟敗毒顆粒18 g,在研缽中研磨成細粉,加40 mL甲醇,超聲處理30 min,靜置過濾后將濾液蒸干,給殘渣加水10 mL溶解,用水飽和的正丁醇溶液振搖提取2次,每次20 mL,合并提取過的正丁醇溶液,將溶液蒸干后的殘渣加甲醇 20 mL,最后將其在中性氧化鋁柱子上(120目,6g,內徑2 cm)洗脫,收集洗脫液并將其濃縮至2 mL,標記為供試品溶液。
2.2.2 陰性對照液的配制
稱取缺少梔子的清瘟敗毒顆粒18 g,在研缽中研磨成細粉,然后按照供試品溶液的制備方法制成缺梔子的陰性對照液。
2.2.3 標準品溶液的配制
稱取梔子苷標準品0.002 g,加2 mL甲醇制成含梔子苷1 mg/mL的溶液,標記為標準品溶液。
2.2.4 鑒別方法
分別吸取供試品溶液、陰性對照液和標準品溶液各4 uL,分別點于同一硅膠G板上,以乙酸乙酯-丙酮-水(550.6)為展開劑,展開,取出晾干,噴以顯色劑(5%的香草醛硫酸溶液),將薄層板置于105 ℃下恒溫至出現清晰斑點。自然光下觀察薄層板,在供試品色譜中,與梔子苷在距離點樣處相同位置出現了相同顏色的清晰斑點,而陰性對照品在此位置沒有顯示任何斑點。說明此方法可以定性鑒別出清瘟敗毒顆粒中的梔子。見圖2、圖3。
圖2 清瘟敗毒顆粒中梔子的TLC圖(噴過顯色劑)1.清瘟敗毒顆粒(缺梔子)陰性;2.清瘟敗毒顆粒樣品;3.梔子苷標準品
圖3 清瘟敗毒顆粒中梔子的TLC圖(105℃加熱后)1.清瘟敗毒顆粒(缺梔子)陰性;2.清瘟敗毒顆粒樣品3.梔子苷標準品
2.3.1 供試品溶液的配制
取清瘟敗毒顆粒樣品6 g,加60%乙醇80 mL,超聲30 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加水20 mL使溶解,水液用水飽和正丁醇振搖提取3次,每次20 mL,合并正丁醇液,蒸干,殘渣加乙醇1 mL使溶解。加中性三氧化二鋁0.5 g,水浴上攪勻,干燥,加在中性三氧化二鋁柱上(100-200目,2 g,內徑1-1.5 cm),用甲醇50 mL洗脫,收集洗脫液,蒸干,殘渣加95%乙醇1 mL使溶解,標記為供試品溶液。
2.3.2 陰性對照液的配制
稱取缺玄參的清瘟敗毒顆粒6 g,按照以上供試品溶液的制備方法處理,標記為缺玄參的陰性對照液。
2.3.3 玄參對照藥材的配制
取玄參對照藥材0.5 g,加乙醇50 mL,超聲30 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加水20 mL使溶解,水液用水飽和的正丁醇振搖提取3次,每次20 mL,合并正丁醇,蒸干,殘渣加95%乙醇1 mL,標記為玄參對照藥材溶液。
2.3.4 鑒別方法
用毛細管分別吸取供試品溶液、陰性對照液和玄參對照藥材溶液,分別點在同一硅膠G板上,以三氯甲烷-甲醇-水(410.1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴5%香草醛硫酸溶液,105 ℃加熱至斑點清晰,檢視玄參陰性、樣品、對照藥材溶液。結果見圖4。
圖4 玄參鑒別薄層圖譜1.清瘟敗毒顆粒(缺玄參)陰性; 2.清瘟敗毒顆粒樣品; 3.玄參對照藥材
從圖4可以看出,清瘟敗毒顆粒樣品與玄參對照藥材在相同位置有同一顏色的斑點,而陰性對照品沒有斑點與玄參對照藥材相對應。說明此方法可以定性鑒別出清瘟敗毒顆粒中的玄參。
薄層色譜法是將固定相涂在玻璃板上,均勻涂布,然后點樣、展開,再依據比移值(Rf)與適宜的對照品按同樣方法得到的色譜比移值做比對,對藥物進行鑒別、雜質檢查和含量測定的方法。其原理是利用藥物中的各種成分對薄層板上的吸附劑的吸附能力不一樣,連續(xù)做出吸附、解吸、再吸附、再解吸的行為,進而達到分離各成分的目的[7]。薄層色譜法主要應用于藥物的定性鑒別,如本文中定性鑒別清瘟敗毒顆粒中赤芍、梔子和玄參。另外,薄層色譜法還可用于藥物的質量控制和雜質檢查,如檢查藥物中的雜質限量;進行化學反應進程控制,對反應副產物和中間體做出分析;探索色譜分離條件,如分離時選用何種吸附劑;對脂質類采用薄層色譜 (TLC) 和柱氣相色譜法測定等。薄層色譜分析可應用于所有化學成分如碳水化合物、苯酚、木質素和萃取物等[8]。影響薄層色譜分析的因素有很多,比如薄層版制備技巧、點樣方法、展開劑的選擇、展開劑的飽和等。
對梔子的提取方法,參照文獻[9]中清瘟敗毒顆粒梔子苷的提取方法,用甲醇超聲,濾過,濾液作為供試品溶液,結果顯示陰性有干擾。又用丙酮進行超聲提取,陰性仍然存在干擾。經查閱藥典、文獻,反復優(yōu)化提取方法,最后確定為用甲醇超聲,并用正丁醇萃取作為供試液,同時將樣品過三氧化鋁柱子,成功將干擾去除。另外,文獻[9]介紹以乙酸乙酯 -丙酮 -甲酸 -水( 10720.5) 為展開劑,噴以10%硫酸乙醇溶液,自 100 ℃開始加熱至斑點顯色清晰,于自然光下檢測梔子苷的存在。但本實驗發(fā)現,展開劑加甲酸后斑點明顯拖尾,于是把甲酸去除,并進一步調整了展開劑中試劑的比例,最后確定展開劑用乙酸乙酯-丙酮-水(550.6),梔子苷斑點清晰、圓整度好。
清瘟敗毒散藥味繁多,其散劑是原藥材粉末直接入藥,可用顯微鑒別法鑒別各藥材成分。清瘟敗毒顆粒是清瘟敗毒散改變劑型的新產品。顆粒劑是飲片經過提取后制成的劑型,沒有了原藥材粉末,不具備散劑的原始藥材結構特點,故不能使用顯微鑒別法。本實驗進行了清瘟敗毒顆粒中赤芍、梔子和玄參的薄層鑒別研究,三種藥材的鑒別結果均斑點清晰、專屬性強,較好地反映了清瘟敗毒顆粒中赤芍、梔子和玄參的質量要求,為清瘟敗毒顆粒質量標準的制定提供了部分實驗依據。